Wild Taq DNA polümeraas
Taq DNA polümeraas on Thermus aquaticus YT-1 termostabiilne DNA polümeraas, millel on 5′→3′ polümeraasi aktiivsus ja 5' klapi endonukleaasi aktiivsus.
Komponendid
| Komponent | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10 × Taq puhver | 2 × 1 ml | 2 × 10 ml | 2 × 50 ml | 5 × 200 ml |
| Taq DNA polümeraas (5 U/μl) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5 × 10 ml |
Ladustamise seisukord
Transportida temperatuuril alla 0°C ja hoida temperatuuril -25°C~-15°C.
Ühiku määratlus
Üks ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis lisab 15 nmol dNTP-d happes lahustumatusse ainesse 30 minuti jooksul temperatuuril 75 °C.
Kvaliteedi kontroll
1.Valgu puhtuse test (SDS-PAGE):Taq DNA polümeraasi puhtus määrati SDS-PAGE analüüsiga ≥95%.
2.Endonnukleaasi aktiivsus:Vähemalt 5 U Taq DNA polümeraasi koos 1 μg λDNA-ga 16 tunni jooksul temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
3.Eksonukleaasi aktiivsus:Vähemalt 5 U Taq DNA polümeraasi koos 1 μg λ-Hind Ⅲ lõhutud DNA-ga 16 tunni jooksul temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
4.Nickase tegevus:Vähemalt 5 U Taq DNA polümeraasi koos 1 μg pBR322 DNA-ga 16 tunni jooksul temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
5.RNaasi aktiivsus:Vähemalt 5 U Taq DNA polümeraasi koos 1,6 μg MS2 RNA-ga 16 tunni jooksul temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
6.E. coliDNA:5 U Taq DNA polümeraasi skriinitakse E. coli genoomse DNA olemasolu suhtes, kasutades TaqMan qPCR koos E. coli 16S rRNA lookuse jaoks spetsiifiliste praimeritega.E. coli genoomse DNA saastumine on ≤1 koopia.
7.PCR amplifikatsioon (5,0 kb lambda DNA)- 50 µl reaktsioon, mis sisaldab 5 ng lambda DNA-d ja 5 ühikut Taq DNA polümeraasi 25 PCR amplifikatsioonitsükli jaoks, annab eeldatava 5,0 kb saaduse.
Reaktsiooni seadistamine
| Komponendid | Helitugevus |
| Malli DNAa | valikuline |
| 10 μM Forward Primer | 1 μL |
| 10 μM pöördpraimer | 1 μL |
| dNTP segu (igaüks 10 mM) | 1 μL |
| 10 × Taq puhver | 5 μL |
| Taq DNA polümeraasb | 0,25 µl |
| Tuumavaba vesi | Kuni 50 μL |
Märkused:
1) Erinevate mallide optimaalne reaktsioonikontsentratsioon on erinev.Järgmine tabel näitab 50 µL reaktsioonisüsteemi soovitatavat malli kasutamist.
| DNA | Summa |
| Genoomiline | 1 ng-1 μg |
| Plasmiid või viiruslik | 1 pg-1 ng |
2) Taq DNA polümeraasi optimaalne kontsentratsioon võib erirakendustes olla vahemikus 0,25 µL ~ 1 µL.
ReaktsioonProgramm
| Samm | Temperatuur(°C) | Aeg | Tsüklid |
| Esialgne denaturatsioona | 95 ℃ | 5 minutit | - |
| Denatureerimine | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 tsüklit |
| Lõõmutamineb | 60 ℃ | 15 s | |
| Laiendus | 72 ℃ | 1 kb/min | |
| Lõplik laiendus | 72 ℃ | 5 minutit | - |
Märkused:
1) Algsed denaturatsioonitingimused sobivad enamiku amplifikatsioonireaktsioonide jaoks ja seda saab muuta vastavalt malli struktuuri keerukusele.Kui malli struktuur on keeruline, saab esialgse denaturatsiooniefekti parandamiseks eeldenatureerimisaega pikendada 5–10 minutini.
2) Anniilimistemperatuuri tuleb reguleerida vastavalt praimeri Tm väärtusele, mis on üldiselt seatud 3–5 ℃ madalamale kui praimeri Tm väärtus;Keeruliste mallide puhul on tõhusa võimenduse saavutamiseks vaja reguleerida lõõmutamistemperatuuri ja pikendada pikendamisaega.
