Proteinaas K (lüofiliseeritud pulber)
Kassi nr: HC4500A
Proteinaas K on stabiilne seriinproteaas, millel on lai substraadi spetsiifilisus.See lagundab paljusid loomulikus olekus valke isegi detergentide juuresolekul.Kristalli- ja molekulaarstruktuuri uuringute tõendid näitavad, et ensüüm kuulub subtilisiinide perekonda, millel on aktiivse saidi katalüütiline triaad (Asp39- Tema oma69- Ser224).Peamine lõhustamiskoht on blokeeritud alfa-aminorühmadega alifaatsete ja aromaatsete aminohapete karboksüülrühmaga külgnev peptiidside.Seda kasutatakse tavaliselt selle laiaulatuslikuks kasutamiseksspetsiifilisus.
Säilitamistingimused
2-8 ℃ lühiajaline ladustamine, -25 ~ -15 ℃ pikaajaline ladustamine.Kuivpulbri staatus -25 ~ -15 ℃ kehtib 3 aastat;ensüümi pulber tuleb lahustada sobivas mahus.
Spetsifikatsioon
| Välimus | Valge kuni valkjas amorfne lüofiliseeritud pulber |
| Tegevus | ≥30 U/mg |
| DNAas | Ühtegi ei tuvastatud |
| RNaasi | Ühtegi ei tuvastatud |
Omadused
| EÜ number | 3.4.21.64 (rekombinantne albumist Tritirachium) |
| Molekulmass | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektriline punkt | 7.81 |
| Optimaalne pH | 7,0-12,0 Joon.1 |
| Optimaalne temperatuur | 65 ℃ Joon.2 |
| pH stabiilsus | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Joon.3 |
| Termiline stabiilsus | Alla 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Joon.4 |
| Aktivaatorid | SDS, uurea |
| Inhibiitorid | diisopropüülfluorofosfaat;fenüülmetüülsulfonüülfluoriid |
Rakendused
1. Geneetilise diagnostika komplekt
2. RNA ja DNA ekstraheerimise komplektid
3. Mittevalguliste komponentide ekstraheerimine kudedest, valguliste lisandite, nt DNA vaktsiinide, lagundamine ja hepariini valmistamine
4. Kromosoomi DNA valmistamine impulsselektroforeesiga
5. Western blot
6. Ensümaatilise glükosüülitud albumiini reaktiivide in vitro diagnostika
Ettevaatusabinõud
Kasutamise või kaalumise ajal kandke kaitsekindaid ja -prille ning hoidke pärast kasutamist hästi ventileeritud.See toode võib põhjustada naha allergilist reaktsiooni ja tõsist silmade ärritust.Sissehingamisel võib see põhjustada allergia- või astmasümptomeid või hingeldust.Võib põhjustada hingamisteede ärritust.
Analüüs
Ühiku määratlus
Üks ühik (U) on ensüümi kogus, mis on vajalik kaseiini hüdrolüüsimiseks, et toota 1 μmol türosiini minutis järgmistel tingimustel.
Reaktiivide ettevalmistamine
Reagent I: 1 g piimakaseiini lahustati 50 ml 0,1 M naatriumfosfaadi lahuses (pH 8,0), inkubeeriti 65-70 ℃ vees 15 minutit, segati ja lahustati, jahutati veega, reguleeriti naatriumhüdroksiidiga pH väärtuseni 8,0 ja fikseeriti maht. 100 ml.
Reagent II: 0,1 M trikloroäädikhape, 0,2 M naatriumatsetaat, 0,3 M äädikhape.
Reaktiiv III: 0,4 M Na2CO3lahendus.
Reagent IV: Forintreaktiiv, mis on lahjendatud puhta veega 5 korda.
Reaktiiv V: ensüümi lahjendi: 0,1 M naatriumfosfaadi lahus (pH 8,0).
Reagent VI: türosiini lahus: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml türosiin, lahustatud 0,2 M HCl-ga.
Menetlus
1. 0,5 ml reaktiivi I eelsoojendatakse temperatuurini 37 ℃, lisatakse 0,5 ml ensüümilahust, segatakse hästi ja inkubeeritakse 37 ℃ juures 10 minutit.
2. Lisage reaktsiooni peatamiseks 1 ml reaktiivi II, segage hästi ja jätkake inkubeerimist 30 minutit.
3. Tsentrifuugige reaktsioonilahus.
4. Võtke 0,5 ml supernatanti, lisage 2,5 ml reaktiivi III, 0,5 ml reaktiivi IV, segage hästi ja inkubeerige 37 ℃ juures 30 minutit.
5. OD660määrati kui OD1;kontrollrühm: OD määramiseks kasutatakse 0,5 ml reaktiivi V ensüümilahuse asendamiseks660kui OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. L-türosiini standardkõver: 0,5 ml erineva kontsentratsiooniga L türosiini lahust, 2,5 ml reaktiivi III, 0,5 ml reaktiivi IV 5 ml tsentrifuugituubis, inkubeerige 37 ℃ 30 minutit, tuvastage OD660L-türosiini erineva kontsentratsiooni korral saadi standardkõver Y=kX+b, kus Y on L-türosiini kontsentratsioon, X on OD600.
Arvutus
2: reaktsioonilahuse kogumaht (ml)
0,5: ensüümi lahuse maht (ml)
0,5: kromogeenseks määramiseks kasutatud reaktsioonivedeliku maht (ml)
10: reaktsiooniaeg (min)
Df: Mitmekordne lahjendus
C: ensüümi kontsentratsioon (mg/ml)
Viited
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. väljaanne, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Joonis 2 Optimaalne temperatuur
Reaktsioon 20 mM K-fosfaatpuhvris pH 8,0.Ensüümi kontsentratsioon: 1mg/ml
Joonis 3 pH Stabiilsus
25 ℃, 16 h-töötlemine 50 mM puhverlahusega: pH 4,5-5,5, atsetaat;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, glütsiin-NaOH.Ensüümi kontsentratsioon: 1mg/ml
Joonis 4 Termiline stabiilsus
30-minutiline töötlemine 50 mM Tris-HCL puhvriga, pH 8,0.Ensüümi kontsentratsioon: 1mg/ml
Joonis 5 Säilitamine stability at 25℃
