Universaalne SYBR GREEN qPCR eelsegu (sinine)
Kassi nr: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (värvipõhine) on 2-kordse reaalajas kvantitatiivse PCR võimenduse eellahus, mida iseloomustab kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus, sinine värv ja proovi lisamise jälgimise efekt.Tuumkomponent Taq DNA polümeraas kasutab antikeha kuumkäivitust, et tõhusalt pärssida mittespetsiifilist amplifikatsiooni proovi ettevalmistamise ajal praimeri anniilimise tõttu.Samal ajal lisab valem soodustavaid tegureid, et parandada PCR reaktsiooni amplifikatsiooni efektiivsust ja võrdsustada erineva GC sisaldusega geenide amplifikatsiooni (30 ~ 70%), nii et kvantitatiivne PCR võib saada hea lineaarse seose laias kvantitatiivses. piirkond.See toode sisaldab spetsiaalset ROX Passive Reference Dye värvi, mida saab kasutada enamiku qPCR-seadmete puhul.ROX-i kontsentratsiooni ei ole vaja erinevatel instrumentidel reguleerida.Reaktsioonisüsteemi ettevalmistamiseks amplifikatsiooniks on vaja lisada ainult praimereid ja malle.
Komponendid
Universaalne sinine qPCR Master Mix
Säilitustingimused
Toode tarnitakse koos jääpakkidega ja seda saab hoida temperatuuril -25 ℃ ~ -15 ℃ 18 kuud.Reaktsioonisüsteemi säilitamisel või valmistamisel tuleb vältida tugevat valguskiirgust.
Spetsifikatsioon
| Keskendumine | 2× |
| Tuvastamismeetod | SYBR |
| PCR meetod | qPCR |
| Polümeraas | Taq DNA polümeraas |
| Proovi tüüp | DNA |
| Rakendusseadmed | Enamik qPCR seadmeid |
| Toote tüüp | SYBR eelsegu reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivseks PCR-iks |
| Rakenda (taotlus) | Geeni ekspressioon |
Juhised
1.Reaktsioonisüsteem
| Komponendid | maht (μL) | maht (μL) | Lõplik kontsentratsioon |
| Universaalne SYBR GREEN qPCR eelsegu | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| Pöördpraimer (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | kuni 50 | kuni 20 | - |
[Märkus]: enne kasutamist segage hoolikalt, et vältida tugevast raputamisest tingitud ülemääraste mullide teket.
a) Praimeri kontsentratsioon: praimeri lõplik kontsentratsioon on 0,2 μmol/L ja seda saab vastavalt vajadusele reguleerida ka vahemikus 0,1 kuni 1,0 μmol/L.
b) Matriitsi kontsentratsioon: kui matriitsiks on lahjendamata cDNA põhilahus, ei tohi kasutatud maht ületada 1/10 qPCR reaktsiooni kogumahust.
c) Matriitsi lahjendus: cDNA põhilahust on soovitatav lahjendada 5-10 korda.Optimaalne lisatud matriitsi kogus on parem, kui võimendusega saadud Ct väärtus on 20-30 tsüklit.
d) Reaktsioonisüsteem: Soovitatav on kasutada 20 μL või 50 μL, et tagada sihtgeeni amplifikatsiooni tõhusus ja korratavus.
e) Süsteemi ettevalmistamine: palun valmistuge ülipuhtal töölaual ja kasutage otsikuid ja reaktsioonitorusid ilma nukleaasijääkideta;otsikuid on soovitatav kasutada filtrikassettidega.Vältige ristsaastumist ja aerosooliga saastumist.
2.Reaktsiooniprogramm
Standardprogramm
| Tsükli samm | Temp. | Aeg | Tsüklid |
| Esialgne denaturatsioon | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denatureerimine | 95℃ | 10 sek | 40 |
| Lõõmutamine/pikendus | 60℃ | 30 sekundit★ | |
| Sulamiskõvera etapp | Instrumendi vaikesätted | 1 | |
Kiire programm
| Tsükli samm | Temp. | Aeg | Tsüklid |
| Esialgne denaturatsioon | 95℃ | 30 sek | 1 |
| Denatureerimine | 95℃ | 3 sek | 40 |
| Lõõmutamine/pikendus | 60℃ | 20 sekundit★ | |
| Sulamiskõvera etapp | Instrumendi vaikesätted | 1 | |
[Märkus]: Kiirprogramm sobib valdava enamuse geenide jaoks ja standardprogramme saab proovida üksikute keerukate sekundaarstruktuuri geenide jaoks.
a) Lõõmutamise temperatuur ja aeg: palun reguleerige vastavalt praimeri ja sihtgeeni pikkusele.
b) Fluorestsentssignaali hankimine (★): palun määrake katseprotseduur vastavalt seadme kasutusjuhendis toodud nõuetele.
c) Sulamiskõver: Instrumendi vaikeprogrammi saab tavapäraselt kasutada.
3. Tulemuste analüüs
Kvantitatiivsete katsete jaoks oli vaja vähemalt kolme bioloogilist kordust.Pärast reaktsiooni tuleb amplifikatsioonikõver ja sulamiskõver kinnitada.
3.1 Võimendikõver:
Standardne võimenduskõver on S-kujuline.Kvantitatiivne analüüs on kõige täpsem, kui Ct väärtus langeb 20 ja 30 vahele. Kui Ct väärtus on väiksem kui 10, on vaja malli lahjendada ja test uuesti läbi viia.Kui Ct väärtus on vahemikus 30-35, on vaja suurendada matriitsi kontsentratsiooni või reaktsioonisüsteemi mahtu, et parandada amplifikatsiooni efektiivsust ja tagada tulemuste analüüsi täpsus.Kui Ct väärtus on suurem kui 35, ei saa testi tulemused kvantitatiivselt analüüsida geeni ekspressiooni, kuid neid saab kasutada kvalitatiivseks analüüsiks.
3.2 Sulamiskõver:
Sulamiskõvera üksik piik näitab, et reaktsiooni spetsiifilisus on hea ja kvantitatiivset analüüsi saab teha;kui sulamiskõver näitab topelt- või mitut piiki, ei saa kvantitatiivset analüüsi teha.Sulamiskõver näitab topeltpiike ja on vaja otsustada, kas mittesihtmärk on praimeri dimeer või mittespetsiifiline amplifikatsioon DNA agaroosgeeli elektroforeesiga.Kui tegemist on praimeri dimeeriga, on soovitatav praimeri kontsentratsiooni vähendada või suure amplifikatsiooniefektiivsusega praimereid ümber kujundada.Kui tegemist on mittespetsiifilise amplifikatsiooniga, suurendage anniilimistemperatuuri või kujundage praimerid spetsiifiliselt ümber.
Märkmed
Palun kandke oma tervise ja ohutuse tagamiseks vajalikke isikukaitsevahendeid, näiteks laborikittlit ja kindaid!
See toode on AINULT teaduslikuks kasutamiseks!
