Hotstart Taq DNA polümeraas
Hot Start Taq DNA polümeraas (antikeha modifikatsioon) on kuumkäivitusega termostabiilne DNA polümeraas, mis pärineb Thermus aquaticus YT-1, millel on 5′→3′ polümeraasi aktiivsus ja 5′ klapi endonukleaasi aktiivsus.Kuumkäivitusega Taq DNA polümeraas on Taq DNA polümeraas, mida modifitseerivad termolabiilsed Taq antikehad.Antikeha modifitseerimine suurendas PCR spetsiifilisust, tundlikkust ja saagist.
Komponendid
| Komponent | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq puhver | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNA polümeraas (antikehaga modifitseeritud) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Rakendused
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 temperatuuril 25 °C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitool, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 ja 50% glütserool.
Ladustamise seisukord
Transportida temperatuuril alla 0°C ja hoida temperatuuril -25°C~-15°C.
Ühiku määratlus
Üks ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis lisab 15 nmol dNTP-d happes lahustumatusse ainesse 30 minuti jooksul temperatuuril 75 °C.
Kvaliteedi kontroll
1.Endonnukleaasi aktiivsus:20 U ensüümi inkubeerimine 4 μg pUC19 DNA-ga 4 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjustanud DNA tuvastatavat lagunemist, mis määrati geelelektroforeesiga.
2.5 kb lambda PCR:5 ng lambda DNA PCR amplifikatsiooni 25 tsüklit 1,25 ühikuga Taq DNA polümeraasiga 200 uM dNTP ja 0,2 uM praimerite juuresolekul annavad oodatud 5 kb produkti.
3.Eksonukleaasi aktiivsus:Vähemalt 12,5 U Taq DNA polümeraasi sisaldava 50 µl reaktsioonisegu inkubeerimine 10 nmol 5'-FAM oligonukleotiidiga 30 minutit temperatuuril 37 ℃ ei anna tuvastatavat lagunemist.
4.RNaasi aktiivsus:10 µl reaktsioonisegu, mis sisaldas 20 U ensüümi, inkubeerimine 1 µg RNA transkriptidega 2 tundi temperatuuril 37 °C ei põhjustanud geelelektroforeesiga määratud RNA tuvastatavat lagunemist.
5.Kuumuse inaktiveerimine:Ei.
Reaktsioonisüsteem
| Komponendid | Helitugevus |
| Malli DNAa | valikuline |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM pöördpraimer | 0,5 μL |
| dNTP segu (igaüks 10 mM) | 0,5 μL |
| 5 × HC Taq puhver | 5 μL |
| Taq DNA polümeraasb(5U/μL) | 0,125 µl |
| Tuumavaba vesi | Kuni 25 μL |
Märkused:
1) a.
| DNA | Summa |
| Genoomiline | 1 ng-1 μg |
| Plasmiid või viiruslik | 1 pg-1 ng |
2) b.Taq DNA polümeraasi optimaalne kontsentratsioon võib erirakendustes olla vahemikus 5-50 ühikut/ml (0,1-0,5 ühikut/25 µL reaktsioon).
Termilise rattasõidu protokoll
PCR
| Samm | Temperatuur(°C) | Aeg | Tsüklid |
| Esialgne denaturatsioona | 95 ℃ | 1-3 minutit | - |
| Denatureerimine | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 tsüklit |
| Lõõmutamineb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Laiendus | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Lõplik laiendus | 68 ℃ | 5 minutit | - |
Märkused:
1) Enamiku amplifikatsioonide jaoks on piisav esialgne denatureerimine 1 min 95 °C juures.Keeruliste mallide puhul on soovitatav pikem denatureerimine 2–3 minutit temperatuuril 95 °C.Koloonia PCR-iga on soovitatav algne 5-minutiline denatureerimine temperatuuril 95 °C.
2) Lõõmutamisetapp on tavaliselt 15-60 s.Lõõmutustemperatuur põhineb praimeripaari Tm-l ja on tavaliselt 45–68 ℃.
