Rnaasi inhibiitor
Hiire RNaasi inhibiitor on rekombinantne hiire RNaasi inhibiitor, mida ekspresseeritakse ja puhastatakse E. colist.See seondub mittekovalentse sideme kaudu RNaasi A, B või C suhtega 1:1, inhibeerides seeläbi kolme ensüümi aktiivsust ja kaitstes RNA-d lagunemise eest.Siiski ei ole see efektiivne Aspergilluse RNaasi 1, RNaasi T1, S1 nukleaasi, RNaasi H või RNaasi vastu.Hiire RNaasi inhibiitorit testiti RT-PCR, RT-qPCR ja IVT mRNA abil ning see ühildus erinevate kaubanduslike pöördtranskriptaaside, DNA polümeraaside ja RNA polümeraasidega.
Võrreldes inimese RNaasi inhibiitoritega ei sisalda hiire RNaasi inhibiitor kaht tsüsteiini, mis on väga tundlikud oksüdatsiooni suhtes, mis põhjustab inhibiitori inaktiveerumist.See muudab selle stabiilseks madalatel DTT kontsentratsioonidel (alla 1 mM).See omadus muudab selle sobivaks kasutamiseks reaktsioonides, kus DTT kõrge kontsentratsioon on reaktsioonile kahjulik (nt reaalajas RT-PCR).
Arakendus
Seda toodet saab laialdaselt kasutada mis tahes katses, kus RNA lagunemise vältimiseks on võimalik RNaasi interferents, näiteks:
1.cDNA esimese ahela süntees, RT-PCR, RT-qPCR jne.
2.Kaitseb RNA-d lagunemise eest in vitro transkriptsiooni/translatsiooni ajal (nt in vitro viiruse replikatsioonisüsteem).
3.RNaasi aktiivsuse pärssimine RNA eraldamise ja puhastamise ajal.
Säilitamistingimused
Toodet võib säilitada temperatuuril -25°-15 ℃, kehtivusaeg 2 aastat.
Salvestuspuhver
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT ja 50% glütserool.
Ühiku määratlus
Hiire RNaasi inhibiitori kogus, mis on vajalik 5 ng ribonukleaas A aktiivsuse inhibeerimiseks 50% võrra, määratleti ühe ühikuna (U).
Valgu molekulmass
Hiire RNaasi inhibiitori molekulmass on 50 kDa.
Kvaliteedi kontroll
Eksonukleaas Tegevus:
40 U hiire RNaasi inhibiitorit koos 1 μg λ-Hind III seeditava DNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei anna agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.
Endonukleaasi aktiivsus:
40 U hiire RNaasi inhibiitorit koos 1 μg λ DNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei anna agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.
Hüüdmine Tegevus:
40 U hiire RNaasi inhibiitorit koos 1 µg pBR322-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei anna agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.
RNaasi Tegevus:
40 U hiire RNaasi inhibiitorit koos 1,6 µg MS2 RNA-ga 4 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.
E.coli DNA:
40 U hiire RNaasi inhibiitorit skriinitakse E. coli genoomse DNA olemasolu suhtes, kasutades TaqMan qPCR koos E. coli 16S rRNA lookuse suhtes spetsiifiliste praimeritega.E. coli genoomse DNA saastatus on ≤ 0,1 pg/40 U.
Ntäheles
1. Tugev võnkumine või segamine põhjustab ensüümi inaktiveerumist.
2. Selle inhibiitori optimaalne temperatuurivahemik oli 25–55 ℃ ja see inaktiveeriti temperatuuril 65 ℃ ja kõrgemal.
3. Hiire RNaasi inhibiitor ei inhibeerinud RNaasi H, RNaasi 1 ja RNaasi T1 aktiivsust.
4. RNaasi aktiivsuse pärssimine leiti laias pH vahemikus (pH 5-9 olid kõik aktiivsed) ja kõrgeimat aktiivsust täheldati pH 7-8 juures.
5. Kuna ribonukleaasid säilitavad tavaliselt aktiivsuse denatureerivates tingimustes, tuleb olla ettevaatlik, et vältida ribonukleaasiga kompleksi moodustanud RNaasi inhibiitori molekulide denatureerimist.Aktiivse ribonukleaasi vabanemise vältimiseks tuleks vältida temperatuure üle 50 °C ning karbamiidi või muude denatureerivate ainete kõrgeid kontsentratsioone.
