Bst 2.0 DNA polümeraas (glütseroolivaba)
Bst DNA polümeraas V2 pärineb Bacillus stearothermophilus DNA polümeraasist I, millel on 5′→3′ DNA polümeraasi aktiivsus ja tugev ahela asendusaktiivsus, kuid puudub 5′→3′ eksonukleaasi aktiivsus.Bst DNA polümeraas V2 sobib ideaalselt ahela nihutamiseks, isotermiliseks amplifikatsiooniks LAMP (loop mediated isothermal amplification) ja kiireks sekveneerimiseks.
Komponendid
| Komponent | HC5005A-01 | HC5005A-02 | HC5005A-03 |
| BstDNApolymerase V2 (glütseroolivaba) (8U/μL) | 0,2 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC Bst V2 puhver | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 2 × 10 ml |
Rakendused
1.LAMP isotermiline võimendus
2.DNA ahela ühe nihke reaktsioon
3. Kõrge GC geenijärjestus
4. Nanogrammi taseme DNA sekveneerimine.
Ladustamise seisukord
Transportida temperatuuril alla 0°C ja hoida temperatuuril -25°C~-15°C.
Ühiku määratlus
Üks ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis lisab 25 nmol dNTP-d happes lahustumatusse ainesse 30 minuti jooksul temperatuuril 65 °C.
Kvaliteedi kontroll
1.Valgu puhtuse test (SDS-PAGE):Bst DNA polümeraasi V2 puhtus on ≥99% määratud SDS-PAGE analüüsiga, kasutades Coomassie Blue detekteerimist.
2.Eksonukleaasi aktiivsus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 μl reaktsioonisegu inkubeerimine 1 μg λ-Hind Ⅲ lõhutud DNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
3.Nickase tegevus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 µl reaktsioonisegu inkubeerimine 1 µg pBR322 DNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
4.RNaasi aktiivsus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 μl reaktsioonisegu inkubeerimine 1,6 μg MS2 RNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
5.E. coli DNA:120 U Bst DNA polümeraasi V2 skriinitakse E. coli genoomse DNA olemasolu suhtes, kasutades TaqMan qPCR koos E. coli 16S rRNA lookuse suhtes spetsiifiliste praimeritega.E. coli genoomse DNA saastumine on ≤1 koopia.
LAMP Reaktsioon
| Komponendid | 25μL |
| 10 × HC Bst V2 puhver | 2,5 μL |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL |
| dNTP-d (igaüks 10 mM) | 3,5 μL |
| SYTO™ 16 roheline (25×)a | 1,0 μL |
| Praimeri segub | 6 μL |
| Bst DNA polümeraas V2 (glütseroolivaba) (8 U/uL) | 1 μL |
| Mall | × μL |
| ddH₂O | Kuni 25 μL |
Märkused:
1) a.SYTOTM 16 Green (25×): Vastavalt eksperimentaalsele vajadusele võib asendusainetena kasutada ka teisi värvaineid;
2) b.Praimeri segu: saadakse 20 uM FIP, 20 uM BIP, 2,5 uM F3, 2,5 uM B3, 5 uM LF, 5 uM LB ja muude mahtude segamisel.
Reaktsioon ja seisund
1 × HC Bst V2 puhvriga, inkubatsioonitemperatuur on vahemikus 60 °C kuni 65 °C.
Kuumuse inaktiveerimine
80 °C, 20 minutit
