RTL pöördtranskriptaas
RTL pöördtranskriptaas on RNA matriitsist sõltuv DNA polümeraas, millel puudub 3'→5' eksonukleaasi aktiivsus ja millel on RNaasi H aktiivsus.See ensüüm võib kasutada RNA-d matriitsina DNA komplementaarse ahela sünteesimiseks, mida saab kasutada esimese ahela cDNA sünteesiks, eriti RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) puhul.Võrreldes RTL pöördtranskriptaasiga 1.0, on tundlikkus oluliselt paranenud, termiline stabiilsus on tugevam ja reaktsioon 65 °C juures on stabiilsem.RTL pöördtranskriptaasi (glütseroolivaba) saab kasutada lüofiliseeritud preparaatide, lüofiliseeritud RT-LAMP reaktiivide jms valmistamiseks.
Ühiku määratlus
Üks ühik sisaldab 1 nmol dTTP-d happega sadestavasse materjali 20 minuti jooksul temperatuuril 50 °C, kasutades polü(A)•oligo(dT)25 matriitsi praimerina.
Komponendid
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL pöördtranskriptaas (glütseroolivaba) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL puhver | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Ladustamise seisukord
Transportida temperatuuril alla 0°C ja hoida temperatuuril -25°C~-15°C.
Kvaliteedi kontroll
- JääkaktiivsusEndonukleaas:50 µl reaktsioon, mis sisaldab 1 µg λDNA-d ja 15 ühikut RTL2.0, mida inkubeeriti 16 tundi temperatuuril 37 ℃, näitab sama mustrit kui negatiivne kontroll geelelektroforeesiga.
- JääkaktiivsusEksonukleaas:50 µl reaktsioon, mis sisaldab 1 µg HindⅢ-ga lõhutud λDNA-d ja 15 ühikut RTL2.0, mida inkubeeriti 16 tundi 37 ℃ juures, näitab sama mustrit, mis geelelektroforeesiga tehtud negatiivse kontrolli puhul.
- JääkaktiivsusNickase:50 µl reaktsioon, mis sisaldab 1 µg superspireeritud pBR322 ja 15 ühikut RTL2.0, mida inkubeeriti 4 tundi 37 °C juures, näitab sama mustrit, mis geelelektroforeesiga tehtud negatiivsel kontrollil.
- JääkaktiivsusRNaasi:10 μl reaktsioon, mis sisaldab 0,48 μg MS2 RNA-d ja 15 ühikut RTL2.0, inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 37 °C, näitab sama mustrit kui negatiivne kontroll geelelektroforeesiga.
- E. coli gDNA:Mõõdetud koosE. colispetsiifilised HCD tuvastuskomplektid, 15 ühikut RTL2.0 sisaldab vähem kui 1E. coligenoom.
Reaktsiooni seadistamine
cDNA sünteesiprotokoll
| Komponendid | Helitugevus |
| Malli RNA a | valikuline |
| Oligo(dT) 18-25 (50 uM) või Random Primer segu (60 uM) | 2 μL |
| dNTP segu (igaüks 10 mM) | 1 μL |
| RNaasi inhibiitor (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL pöördtranskriptaas 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL puhver | 2 μL |
| Tuumavaba vesi | Kuni 20 μL |
Märkused:
1) Total RNA soovitatav annus on 1 ng ~ 1 μg
2) mRNA soovitatav annus oli 50-100 ng
Termo-rattasõit Rutiini tingimused reaktsioon:
| Temperatuur (°C) | Aeg |
| 25 °Ca | 5 minutit |
| 55 °C | 10 minutitb |
| 80 °C | 10 minutit |
Märkused:
1) Kui kasutatakse Random Primer Mix, inkubeerige 25 °C juures.
2) Kui kasutatakse sihtpraimeri segu, inkubeerige 55 °C juures 10-30 minutit.
RT-LAMP protokoll
| Komponendid | Helitugevus | Lõplik kontsentratsioon |
| Malli RNA | valikuline | ≥10 koopiat |
| dNTP segu (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP praimerid (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 praimerid (25×) | 1 μL | 0,2 µM |
| LoopF/LoopB praimerid (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNaasi inhibiitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U / reaktsioon |
| RTL pöördtranskriptaas 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U / reaktsioon |
| Bst V2 DNA polümeraas (8U/μL) | 1 μL | 8 U / reaktsioon |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (kokku 8 mM) |
| 10 × HC RTL puhver (või 10 × HC Bst V2 puhver) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Tuumavaba vesi | Kuni 25 μL | - |
Märkused:
1) Segage vorteksiga ja tsentrifuugige lühidalt, et koguda.Inkubeerimine püsival temperatuuril 65°C 1 tund.
2) Kaks puhvrit on koostalitlusvõimelised ja neil on sama koostis.
Märkmed
1. See toode moodustab valge tahke aine, kui seda hoitakse temperatuuril -20 °C.Võta see -20°C juurest välja ja pane umbes 10 minutiks jääle.Pärast sulamist saab seda kasutada loksutades ja segades.
2. cDNA saadust võib säilitada -20 °C või -80 °C juures või kasutada kohe PCR reaktsioonis.
3. RNaasi saastumise vältimiseks hoidke katseala puhas ning kandke töötamise ajal puhtaid kindaid ja maske.
