Proteinaas K mNGS (vedel)
Proteinaas K on stabiilne seriinproteaas, millel on lai substraadi spetsiifilisus.See lagundab paljusid loomulikus olekus valke isegi detergentide juuresolekul.Kristalli- ja molekulaarstruktuuri uuringute tõendid näitavad, et ensüüm kuulub subtilisiinide perekonda, millel on aktiivse saidi katalüütiline triaad (Asp39- Tema oma69- Ser224).Peamine lõhustamiskoht on blokeeritud alfa-aminorühmadega alifaatsete ja aromaatsete aminohapete karboksüülrühmaga külgnev peptiidside.Seda kasutatakse tavaliselt selle laia spetsiifilisuse tõttu.See proteinaas K on spetsiaalselt loodud mNGS jaoks.Võrreldes teise proteinaas K-ga sisaldab see sama ensümaatilise jõudlusega veelgi vähem nukleiinhappesaastet, mis võiks paremini tagada allavoolu mNGS-i rakenduse.
Säilitamistingimused
2-8 ℃ 2 aastat
Spetsifikatsioon
| Välimus | Värvitu kuni helepruun vedelik |
| Tegevus | ≥800 U/ml |
| Valgu kontsentratsioon | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ühtegi ei tuvastatud |
| DNAas | Ühtegi ei tuvastatud |
| RNaasi | Ühtegi ei tuvastatud |
Omadused
| EÜ number | 3.4.21.64(Rekombinantne Tritirachiumi albumist) |
| Isoelektriline punkt | 7.81 |
| Optimaalne pH | 7,0- 12,0 Joon. 1 |
| Optimaalne temperatuur | 65 ℃ Joonis 2 |
| pH stabiilsus | pH 4,5–12,5 (25 ℃, 16 h) Joon. 3 |
| Termiline stabiilsus | Alla 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Joonis 4 |
| Ladustamise stabiilsus | Üle 90% aktiivsus 12 kuud temperatuuril 25 ℃ |
| Aktivaatorid | SDS, uurea |
| Inhibiitorid | diisopropüülfluorofosfaat;fenüülmetüülsulfonüülfluoriid |
Rakendused
1. Geneetilise diagnostika komplekt
2. RNA ja DNA ekstraheerimise komplektid
3. Mittevalguliste komponentide ekstraheerimine kudedest, valguliste lisandite, nt DNA, lagundaminevaktsiinid ja hepariini valmistamine
4. Kromosoomi DNA valmistamine impulsselektroforeesiga
5. Western blot
6. Ensümaatilise glükosüülitud albumiini reaktiivide in vitro diagnostika
Ettevaatusabinõud
Kasutamise või kaalumise ajal kandke kaitsekindaid ja -prille ning hoidke pärast kasutamist hästi ventileeritud.See toode võib põhjustada naha allergilist reaktsiooni ja tõsist silmade ärritust.Sissehingamisel võib see põhjustada allergia- või astmasümptomeid või hingeldust.Võib põhjustada hingamisteede ärritust.
Ühiku määratlus
Üks ühik (U) on ensüümi kogus, mis on vajalik kaseiini hüdrolüüsimiseks, et toota 1 μmoltürosiini minutis järgmistel tingimustel.
Reaktiivide ettevalmistamine
Reagent I: 1 g piimakaseiini lahustati 50 ml 0,1 M naatriumfosfaadi lahuses (pH 8,0), inkubeeriti 65-70 ℃ vees 15 minutit, segati ja lahustati, jahutati veega, reguleeriti naatriumhüdroksiidiga pH väärtuseni 8,0 ja fikseeriti maht. 100 ml.
Reagent II: 0,1 M trikloroäädikhape, 0,2 M naatriumatsetaat, 0,3 M äädikhape.
Reaktiiv III: 0,4 M Na2CO3lahendus.
Reagent IV: Forintreaktiiv, mis on lahjendatud puhta veega 5 korda.
Reaktiiv V: Ensüümi lahjendi: 0,1 M naatriumfosfaadi lahus (pH 8,0).
Reagent VI: türosiini lahus: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml türosiini, mis on lahustatud 0,2M HCl.
Menetlus
1. 0,5 ml reaktiivi I eelsoojendatakse temperatuurini 37 ℃, lisatakse 0,5 ml ensüümilahust, segatakse hästi ja inkubeeritakse temperatuuril37 ℃ 10 minutit.
2. Lisage reaktsiooni peatamiseks 1 ml reaktiivi II, segage hästi ja jätkake inkubeerimist 30 minutit.
3. Tsentrifuugige reaktsioonilahus.
4. Võtke 0,5 ml supernatanti, lisage 2,5 ml reaktiivi III, 0,5 ml reaktiivi IV, segage hästi ja inkubeerige 37 ℃ juures.30 minutiks.
5. OD660määrati kui OD1;tühi kontrollrühm: ensüümi asendamiseks kasutatakse 0,5 ml reaktiivi Vlahendus OD määramiseks660kui OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. L-türosiini standardkõver: 0,5 ml erineva kontsentratsiooniga L-türosiini lahust, 2,5 ml reaktiivi III, 0,5 ml reaktiivi IV 5 ml tsentrifuugituubis, inkubeerida temperatuuril 37 ℃ 30 minutit, OD tuvastamine660L-türosiini erineva kontsentratsiooni korral saadi standardkõver Y=kX+b, kus Y on L-türosiini kontsentratsioon, X on OD600.
Arvutus
2: reaktsioonilahuse kogumaht (ml)
0,5: ensüümi lahuse maht (ml)
0,5: kromogeenseks määramiseks kasutatud reaktsioonivedeliku maht (ml)
10: reaktsiooniaeg (min)
Df: Mitmekordne lahjendus
C: ensüümi kontsentratsioon (mg/ml)
Viited
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. väljaanne, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Arvud
Joonis fig.1 Optimaalne pH
100 mM puhverlahus: pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glütsiin-NaOH. Ensüümi kontsentratsioon: 1 mg/ml
Joon.2 Optimaalne temperatuur
Reaktsioon 20 mM K-fosfaatpuhvris pH 8,0.Ensüümi kontsentratsioon: 1 mg/ml
Joonis 3 pH Stabiilsus
25 ℃, 16 h töötlus 50 mM puhverlahusega: pH 4,5-5,5, atsetaat;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glütsiin-NaOH.Ensüümi kontsentratsioon: 1 mg/ml
Joon.4 Termiline stabiilsus
30 min töötlus 50 mM Tris-HCl puhvriga, pH 8,0.Ensüümi kontsentratsioon: 1 mg/ml
Joon.5 Hoiustamine stability at 25℃
