2 × Sensi Direct Premix-UNG (sond qPCR)
Kassi nr: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) on loodud PCR tegemiseks otse proovidest ilma DNA ekstraheerimise või proovi ettevalmistamiseta.See reaktiiv koosneb kuumkäivitusega DNA polümeraasist, uratsiili DNA glükosülaasist (UNG), RNaasi inhibiitorist, MgCl2, dNTP-d (dTTP asemel dUTP-ga) ja stabilisaatorid kvantitatiivse PCR (qPCR) jaoks.Sellel reaktiivil on kõrge inhibiitoritaluvus ja seega saab seda otse kasutada proovide, nagu kõri tampooni, sülje, hüübimisvastase täisvere, plasma ja seerumi tuvastamiseks ilma DNA ekstraheerimiseta.Reaktiiv kasutab qPCR jaoks patenteeritud puhvrit koos inhibeeriva DNA polümeraasi ja UNG ensüümi segaensüümidega.Seetõttu võib see saavutada sihtgeenide hea amplifikatsiooni inhibiitoreid sisaldavates proovides ja pärssida PCR-i jääk- ja aerosoolsaaste põhjustatud valepositiivset amplifikatsiooni.See reaktiiv ühildub enamiku fluorestseeruvate kvantitatiivsete PCR-seadmetega, nagu Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche ja nii edasi.
Komponendid
1. 50 × SensiDirect Enzyme/UNG segu
2. 2 × SensiDirecti eelsegu puhver (dUTP)
Säilitustingimused
Kõiki komponente tuleb hoida temperatuuril -20 ℃ pikaajaliseks säilitamiseks ja 4 ℃ kuni 3 kuud.Pärast sulatamist segage hoolikalt ja tsentrifuugige enne kasutamist.Vältige sagedast külmutamist-sulatamist.
Jalgrattasõidu protokoll
| Samm | Temperatuur | Aeg | Tsükkel |
| Seedimine | 50℃ | 2 min | 1 |
| Polümeraasi aktiveerimine | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Denatureerimine | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Lõõmutamine/pikendus | 56-64 ℃ | 20-60ndad |
Pipeteerimise juhised
| Reaktiiv | Maht per reaktsioon | Maht reaktsiooni kohta | Lõplik kontsentratsioon |
| 2 × SensiDirect eelsegu puhver (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50 × SensiDirect ensüümi/UNG segu | 0,5 µl | 1 µL | 1× |
| 25 × krunt-sondi segu1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Näidis3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Kogumaht | 25 μL | 50 μL | - |
1. Praimeri lõppkontsentratsioon on tavaliselt 0,2 μM.Paremate tulemuste saavutamiseks saab praimeri kontsentratsiooni optimeerida vahemikus 0,2-1 μM.
2. Üldiselt saab sondi kontsentratsiooni optimeerida vahemikus 0,1–0,3 μM.Sondi optimaalne kontsentratsioon on seotud reaalajas PCR amplifikatsiooniseadme, sondi tüübi ja fluorestseeruva märgistusaine tüübiga.Vaadake instrumendi kasutusjuhendit või iga fluorestsentssondi spetsiifilisi nõudeid.
3. Erinevat tüüpi proovid sisaldavad erinevat tüüpi ja erinevat sisu inhibiitorit ja sihtgeeni koopiate arvu.Proovi mahtu tuleks arvestada tegeliku seisundi alusel.Proovi lahjendada, lisades vajadusel nukleaasivaba vett või TE puhvrit.
4. Erinevate proovide soovitatav kogus:
| Näidis | Maht ühele 50 μL reaktsioon | Maksimaalne suhe |
| Antikoaguleeritud täisveri | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30% |
| Seerum | 10 μL | 20% |
| Kurgu tampoon | 10 μL | 20% |
| Sülg | 10 μL | 20% |
Kvaliteedi kontroll
1. Funktsiooni tuvastamine: qPCR tundlikkus, spetsiifilisus ja korratavus.
2. Eksogeense nukleaasi aktiivsus puudub: eksogeense endonukleaasi ja eksonukleaasi reostus puudub.
Toote märkmed
1. See toode kasutab uut tüüpi kuumkäivitusega DNA polümeraasi, mida saab aktiveerida 1-5 minutiga. Kuna selle reaktsioonipuhver on optimeeritud, sobib see paremini topelt- või mitmekordse fluorestsentsiga kvantitatiivseks PCR-iks, kasutades sondimeetodit.
2. Kui PCR amplifikatsiooni Rn väärtus on liiga madal või amplifikatsioon on ilmselgelt pärsitud, võib proovi koguse vähendamine, reaktsioonimahu suurendamine või proovi eelnev lahjendamine tulemusi parandada.
3. Vere, sülje, uriini, kurgu tampooni jms kogumisel tuleb järgida kliiniliste kriteeriumide nõudeid ja värsket proovi võib kasutada nukleiinhappe lagunemise vältimiseks.
4. Kuna erinevatel amplikonitel on erinev kasutusefektiivsus dUTP-st ja tundlikkus UNG suhtes, tuleks reaktiive optimeerida, kui tuvastamise tundlikkus UNG-süsteemi kasutamisel väheneb.Vajadusel võtke meiega ühendust tehnilise toe saamiseks.
5. Et vältida ülekanduvate PCR-produktide amplifitseerimist üheetapiliste reaktsioonide vahel, on amplifikatsiooniks vaja spetsiaalset katseala ja pipetti.Töötage kinnastega ja vahetage sageli ning ärge avage reaktsioonitoru pärast PCR amplifikatsiooni.
