5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kassi nr: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) on väga stabiilne ühe katseklaasi sondipõhine segu, mis sobib üheastmeliseks pöördtranskriptsiooniks ja kvantitatiivseks PCR-iks (qRT-PCR).See toetab praimerite ja sondide eelsegamist ning püsib stabiilsena pärast pikka madalal temperatuuril hoidmist.Testitava proovi saab lisada otse kasutamise ajal ilma täiendava toru avamise/pipeteerimiseta.See toode sisaldab komponente, nt kuumkäivitusega DNA polümeraas, M-MLV, kuumuslabiilne uratsiil-DNA glükosülaas (TS-UNG), RNaasi inhibiitor, MgCl2, dNTP-d (dTTP asemel dUTP-ga) ja stabilisaatorid.Geneetiliselt muundatud kiiramplifikatsiooni pöördtranskriptaasi ja DNA polümeraasiga on võimalik PCR amplifikatsioon lõpule viia 20-40 minutiga.See reagent kasutab qPCR jaoks spetsiaalset puhvrit koos inhibeeriva amplifikatsiooni ensüümi ja UNG ensüümi segaensüümidega.Seetõttu võib see saavutada sihtgeenide hea amplifikatsiooni ja vältida PCR-i jääk- ja aerosoolsaaste põhjustatud vale amplifikatsiooni.See reaktiiv ühildub enamiku fluorestsents-kvantitatiivsete PCR-seadmetega sellistelt tootjatelt nagu Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ja Roche.
Komponent
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT eelsegupuhver (dUTP)
Säilitamistingimused
Kõiki komponente tuleb hoida temperatuuril -20 ℃ pikaajaliseks säilitamiseks ja 4 ℃ kuni 3 kuud.Pärast sulatamist segage hoolikalt ja tsentrifuugige enne kasutamist.Vältige sagedast külmutamist-sulatamist.
qRT-PCR reaktsioonisüsteemi ettevalmistamine
| Komponendid | 25μLSüsteem | 50μLSüsteem | Lõplik kontsentratsioon |
| 5 × Neoscript Fast RT eelsegupuhver (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25 × krunt-sondi segua | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Malli RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Kuni 25 μL | Kuni 50 μL | – |
1) a. Praimeri lõppkontsentratsioon on tavaliselt 0,2 μM.Paremate tulemuste saavutamiseks saab praimeri kontsentratsiooni optimeerida vahemikus 0,2-1 μM.Üldiselt saab sondi kontsentratsiooni optimeerida vahemikus 0,1–0,3 μM.
2) b.Kiire PCR-protseduuri kasutamisel võib praimerite ja sondide kontsentratsiooni suurendamine anda paremaid amplifikatsioonitulemusi ning nende suhet tuleks vastavalt optimeerida.
3) Erinevat tüüpi proovid sisaldavad erinevat tüüpi ja erinevat sisu inhibiitorit ja sihtgeeni koopiate arvu.Proovi mahtu tuleks arvestada tegeliku seisundi alusel.Vajadusel lahjendage proovi nukleaasivaba vee või TE puhvriga.
Reaktsioon Ctingimused
| Regulaarne PCR protseduur | Kiire PCR protseduur | ||||||
| Menetlus | Temp. | Aeg | Tsükkel | Menetlus | Temp. | Aeg | Tsükkel |
| Pöördtranskriptsioon | 50℃ | 10-20 minutit | 1 | Pöördtranskriptsioon | 50℃ | 5 minutit | 1 |
| Polümeraas Aktiveerimine | 95℃ | 1-5 minutit | 1 | Polümeraas Aktiveerimine | 95℃ | 30ndad | 1 |
| Denatureerimine | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denatureerimine | 95℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Lõõmutamine ja Laiendus | 56-64 ℃ | 20-60ndad | Lõõmutamine ja Laiendus | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kvaliteedi kontroll
1.Funktsiooni tuvastamine: qPCR tundlikkus, spetsiifilisus ja korratavus.
2.Eksogeense nukleaasi aktiivsus puudub: eksogeense endonukleaasi ja eksonukleaasi saaste puudub.
Märkmed
1.Kiire DNA polümeraasi amplifikatsioonikiirus ei ole väiksem kui 1 kb/10 s.Erinevatel PCR-seadmetel on erinevad kütte- ja jahutuskiirused, temperatuuri reguleerimise režiimid ja soojusjuhtivus ning seega on teie praimeri/sondi kontsentratsiooni ja töömeetodi optimeerimine koos teie konkreetse kiire PCR-instrumendiga hädavajalik.
2.See toode on laialdaselt rakendatav ja sobib ülitundlikuks molekulaardiagnostikaks.Kolmeetapiline PCR meetod on soovitatav madala anniilimistemperatuuriga praimerite või pikkade üle 200 aluspaari pikkuste fragmentide amplifitseerimiseks.
3.Kuna erinevatel amplikonitel on erinev dUTP kasutamise efektiivsus ja erinev tundlikkus UNG suhtes, tuleks reaktiive optimeerida, kui tuvastamise tundlikkus UNG-süsteemi kasutamisel väheneb.Vajadusel võtke meiega ühendust tehnilise toe saamiseks.
4.Ülekanduvate PCR-toodete amplifikatsiooni vältimiseks on amplifikatsiooniks vaja spetsiaalset katseala ja pipetti.Töötage kinnastega ja vahetage sageli ning ärge avage PCR-tuubi pärast amplifikatsiooni.
