Proteinaas K NGS (pulber)
Kassi nr: HC4507A
NGS Proteaas K on stabiilne seriinproteaas, millel on kõrge ensüümi aktiivsus ja lai substraadi spetsiifilisus. Ensüüm lagundab eelistatult hüdrofoobsete aminohapete, väävlit sisaldavate aminohapete ja aromaatsete aminohapete C-otsaga külgnevaid estersidemeid ja peptiidsidemeid.Seega kasutatakse seda sageli valkude lagundamiseks lühikesteks peptiidideks.NGS proteaas K on tüüpiline seriinproteaas koos Asp39- Tema oma69- Ser224katalüütiline triaad, mis on ainulaadne seriinproteaasidele, ja katalüütilist keset ümbritseb taks Ca2+sidumissaite stabiliseerimiseks, säilitades kõrge ensüümi aktiivsuse laiemas vahemikus.
Spetsifikatsioon
| Välimus | Valge kuni valkjas amorfne pulber, lüofiliseeritud |
| Konkreetne tegevus | ≥40U/mg tahke aine |
| DNAas | Ühtegi ei tuvastatud |
| RNaasi | Ühtegi ei tuvastatud |
| Biokoormus | ≤50 CFU/g tahke aine |
| Nukleiinhappe jääk | <5pg/mg tahket ainet |
Omadused
| Allikas | Tritirachiumi album |
| EÜ number | 3.4.21.64(Rekombinantne Tritirachiumi albumist) |
| Molekulmass | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektriline punkt | 7.81 Joon.1 |
| Optimaalne pH | 7,0-12,0 (Kõik täidavad kõrget aktiivsust) Joon.2 |
| Optimaalne temperatuur | 65℃ Joon.3 |
| pH Stabiilsus | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Joon.4 |
| Termiline stabiilsus | Alla 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Joon.5 |
| Ladustamise stabiilsus | Säilitatud temperatuuril 25 ℃ 12 kuud Joon.6 |
| Aktivaatorid | SDS, uurea |
| Inhibiitorid | diisopropüülfluorofosfaat;bensüülsulfonüülfluoriid |
Säilitamistingimused
Hoidke lüofiliseeritud pulbrit pikka aega valguse eest kaitstult temperatuuril -25–15 ℃;Pärast lahustumist jagage alikvoot sobivasse mahutisse lühiajaliseks säilitamiseks temperatuuril 2–8 ℃ valguse eest kaitstult või pikaajaliseks säilitamiseks temperatuuril -25–15 ℃ valguse eest kaitstult.
Ettevaatusabinõud
Kasutamise või kaalumise ajal kandke kaitsekindaid ja -prille ning hoidke pärast kasutamist hästi ventileeritud.See toode võib põhjustada naha allergilist reaktsiooni ja tõsist silmade ärritust.Sissehingamisel võib see põhjustada allergia- või astmasümptomeid või hingeldust.Võib põhjustada hingamisteede ärritust.
Ühiku määratlus
Üks ühik NGS proteaas K on määratletud kui ensüümi kogus, mis on vajalik kaseiini hüdrolüüsimiseks 1 μmol L-türosiiniks standardsetes määramistingimustes.
Reaktiivide ettevalmistamine
| Reaktiiv | Tootja | Kataloog |
| Kaseiin tehnilineveisepiimast | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trikloroäädikhape | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Naatriumatsetaati | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Äädikhape | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Naatriumkarbonaat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foliin-fenool | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-türosiin | Sigma | 93829 |
Reaktiiv I:
Substraat: 1% kaseiin veisepiima lahusest: lahustage 1 g veisepiima kaseiini 50 ml 0,1 M naatriumfosfaadi lahuses, pH 8,0, kuumutage veevannis 65-70 °C juures 15 minutit, segage ja lahustage, jahutage veega, reguleerige naatriumhüdroksiidi pH väärtuseni 8,0 ja lahjendada 100 ml-ni.
Reaktiiv II:
TCA lahus: 0,1 M trikloroäädikhape, 0,2 M naatriumatsetaati ja 0,3 M äädikhapet (kaalake järjestikku 1,64 g trikloroäädikhapet + 1,64 g naatriumatsetaati + 1,724 ml äädikhapet, lisage 50 ml deioniseeritud vett, lahjendage pH 4,0-ga HCl-ni. 100 ml).
Reaktiiv III:
0,4 m naatriumkarbonaadi lahus (kaalake 4,24 g veevaba naatriumkarbonaati ja lahustage 100 ml vees)
Reaktiiv IV:
Foliinfenoolreaktiiv: lahjendage 5 korda deioniseeritud veega.
Reaktiiv V:
Ensüümi lahjendi: 0,1 M naatriumfosfaadi lahus, pH 8,0.
Reaktiiv VI:
L-türosiini standardlahus: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml 0,2 M HCl-ga lahustatud L-türosiin.
Menetlus
1. Lülitage UV-Vis spektrofotomeeter sisse ja valige fotomeetriline mõõtmine.
2. Seadke lainepikkuseks 660 nm.
3. Lülitage veevann sisse, seadke temperatuur 37 ℃-ni, tagage temperatuur muutumatuks 3-5 minutiks.
4. Eelsoojendage 0,5 ml substraati 2 ml tsentrifuugituubis 37 ℃ veevannis 10 minutit.
5. Ekstraheerige 0,5 ml lahjendatud ensüümi lahust eelsoojendatud tsentrifuugitorusse 10 minutiks.Määrake ensüümi lahjendi tühirühmaks.
6. Lisage kohe pärast reaktsiooni 1,0 ml TCA reaktiivi.Segage hästi ja inkubeerige veevannis 30 minutit.
7. Tsentrifuugige reaktsioonilahus.
8. Lisage järgmised komponendid määratud järjekorras.
| Reaktiiv | Helitugevus |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4 M naatriumkarbonaat | 2,5 ml |
| Foliinfenoolreaktiiv | 0,5 ml |
9. Segage hoolikalt enne inkubeerimist veevannis temperatuuril 37 ℃ 30 minutit.
10. OD660määrati kui OD1;pimekatserühm: OD määramiseks kasutatakse ensüümi lahjendit660kui OD2, ΔOD = OD1-OD2.
11. L-türosiini standardkõver: 0,5 ml erineva kontsentratsiooniga L-türosiini lahust, 2,5 ml 0,4 M naatriumkarbonaati, 0,5 ml foliini fenoolreaktiivi 5 ml tsentrifuugituubis, inkubeerige 37 ℃ 30 minutit, tuvastage OD660L-türosiini erineva kontsentratsiooni korral saadakse standardkõver Y=kX+b, kus Y on L-türosiini kontsentratsioon, X on OD600.
Arvutus
2: reaktsioonilahuse kogumaht (ml)
0,5: ensüümi lahuse maht (ml)
0,5: kromogeenseks määramiseks kasutatud reaktsioonivedeliku maht (ml)
10: reaktsiooniaeg (min)
Df: Mitmekordne lahjendus
C: ensüümi kontsentratsioon (mg/ml)
Arvud
Joonis 1 DNA jääk
| Näidis | Ave C4 | Nukleiinhape Taastumine (pg/mg) | Taastumine (%) | Kogu nukleiinhape Hape ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-vaba H2O | Määramata | — | — | — |
Joon.2 Optimaalne pH
Joon.3 Optimaalne temperatuur
Joonis 4 pH stabiilsus
Joon.5 Termiline stabiilsus
Joon.6 Säilitamisstabiilsus temperatuuril 25 ℃
