EndoFree Plasmid Maxi komplekt
See komplekt sobib ekstraheerimiseks 150–300 ml üleöö kultiveeritud bakterilahusest, kasutades bakterite lüüsimiseks täiustatud SDS-aluselise lüüsi meetodit.Toorekstrakt kombineeritakse valikuliselt ainulaadse Endotoxin Scavengeriga ja eraldatakse tsentrifuugimisega, et eemaldada endotoksiinid.Seejärel seondub silikageeli membraan selektiivselt lahuses oleva plasmiidse DNA-ga kõrge soolasisalduse ja madala pH tingimustes.Sellele järgneb pesupuhvri lisamine lisandite ja muude bakteriaalsete komponentide eemaldamiseks.Lõpuks kasutatakse puhta plasmiidse DNA elueerimiseks ränimatriksmembraanilt madala soolasisaldusega kõrge pH-ga elueerimispuhvrit.Silikageeli membraan kasutab spetsiaalset adsorptsioonimembraani ning adsorptsioonikoguse erinevus kolonni ja kolonni vahel on väga väike ja korratavus on hea.Fenooli, kloroformi ja muid mürgiseid reaktiive pole vaja, samuti pole vaja etanooli sadestamist.Seda komplekti saab kasutada 0,2–1,5 mg puhta suure koopiaga plasmiidse DNA kiireks ekstraheerimiseks ekstraheerimiskiirusega 80–90%.Komplektis kasutatakse ainulaadset protsessivalemit, mis eemaldab endotoksiini, endotoksiini sisaldus on äärmiselt madal ja rakkude transfektsiooniefekt on suurepärane.Ekstraheeritud plasmiidi saab otseselt kasutada ensüümidega lagundamisel, PCR-il, in vitro transkriptsioonil, transformatsioonil, sekveneerimisel ja muudes molekulaarbioloogia katsetes.
Säilitustingimused
RNaasA tuleks hoida temperatuuril -30 ~ -15 ℃ ja transportida temperatuuril ≤0 ℃.
Endotoxin Scavengerit võib hoida temperatuuril 2 ~ 8 ℃ üks kuu, hoida -30 ~ -15 ℃ juures pikaajaliseks säilitamiseksja transporditakse temperatuuril ≤0 ℃.
Muid komponente tuleb hoida toatemperatuuril (15 ~ 25 ℃) ja transportida toatemperatuuril.
Komponendid
| Komponendid | 10RXNS |
| RNaas A | 750 µl |
| Puhver P1 | 75 ml |
| Puhver P2 | 75 ml |
| Puhver P4 | 75 ml |
| Endotoksiinide püüdja | 25 ml |
| Puhver PW | 2 × 22 ml |
| TB puhver | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi kolonnid (igaüks 50 ml kogumistuubis) | 10 |
| Endotoksiinivaba kogumistuub | 2 × 5 |
RNaasA:10 mg/ml, kasutatakse RNA eemaldamiseks.
Puhver P1:bakterisuspensiooni puhver, lisage RNaseA puhvrile P1 enne esimest kasutamist.
Puhver P2:bakteriaalne lüüsi puhver (sisaldab SDS/NaOH).
Puhver P4:neutraliseeriv puhver.
Endotoksiinide püüdja:eemaldab tõhusalt endotoksiini toorplasmiidiekstraktist.
Puhver PW:pesupuhvrit, lisage enne esmakordset kasutamist ettenähtud kogus etanooli.
TB puhver:elueerimispuhver.
FastPure DNA Maxi kolonnid:plasmiidse DNA adsorptsiooni kolonnid.
Kogumistuubid 50 ml:filtraadi kogumistorud.
Endotoksiinivaba kogumistuub:plasmiidse DNA kogumistuubid.
Ettevalmistatud materjalid
Absoluutne etanool, isopropanool, 50 ml ümarapõhjalised tsentrifuugitorud ja 50 ml endotoksiinivabatsentrifuugitorud.
Rakendused
See toode sobib plasmiidide suuremahuliseks ekstraheerimiseks 150–300 ml bakterilahusestkultiveeritakse üleöö.
Katseprotsess
1. Võtke 150–200 ml (mitte rohkem kui 300 ml) üleöö kultiveeritud bakterilahust ja tsentrifuugigeumbes 11 000 pööret minutis (12 000 × g) 1–2 minuti jooksul.Supernatant visake ära ja koguge bakterid kokku.
Δ Kui kogute rohkem kui 50 ml bakterilahust, saab baktereid koguda bakterilahuse lisamise, tsentrifuugimise, supernatandi äraviskamise ja muude sammude abil samas 50 ml tuubis.
mitu korda.
2. Lisage tsentrifuugi 7,5 ml puhvrit P1 (kontrollige, kas puhvrile P1 on lisatud RNaasAbaktereid sisaldavasse torusse ja segage hoolikalt keerise või pipetiga.
Δ Bakterite täielik resuspendeerimine selles etapis on saagise saamiseks kriitilise tähtsusega ja pärast resuspendeerimist ei tohiks olla bakterite tükke.Kui on bakterite tükke, mida ei ole põhjalikult segatud, mõjutab see lüüsi, mille tulemuseks on madal saagis ja puhtus.Kui bakterilahuse OD600 on 0,65, on 150 ml bakterilahusest ekstraheerimisel soovitatav kasutada 7,5 ml puhvrit P1;kui OD600 on 0,75, tuleks kasutada 8 ml puhvrit P1 ning puhvrite P2 ja P4 mahtusid vastavalt muuta.Kui bakterilahuse mahtu suurendatakse 200 ml-ni, on soovitatavpuhvrite P1, P2 ja P4 mahtu suurendatakse proportsionaalselt.
3. Lisage etapis 2 saadud bakterisuspensioonile 7,5 ml puhvrit P2 ja segage õrnalt üles-alla 6–8korda ja inkubeerige toatemperatuuril 4–5 minutit.
Δ Hoolikalt segamiseks pöörake õrnalt ümber.Vortexing põhjustab genoomse DNA fragmentatsiooni, mille tulemuseks on genoomse DNA fragmendid ekstraheeritud plasmiidis.Sel ajal muutub lahus viskoosseks ja poolläbipaistvaks, mis näitab, et bakterid on täielikult lüüsitud.Plasmiidide hävimise vältimiseks ei tohiks kestus ületada 5 minutit.Kui lahus pole selge, võib tulemuseks olla liiga palju baktereidmittetäielik lüüs, mistõttu tuleks bakterite hulka asjakohaselt vähendada.
4. Lisage 7.5 ml puhvrit P4 3. etapis saadud bakterisuspensioonile ja pöörake kohe õrnalt 6–8 korda ümber, et lasta lahusel puhver P2 täielikult neutraliseerida.Sel ajal peaks ilmuma valge helbeline sade.Tsentrifuugige rohkem kui umbes 11 000 p/min (12 000 × g) 10–15 minutit, pipetige supernatant ettevaatlikult uude 50 ml ümarapõhjalisse tsentrifuugitorusse (isevalmistatud) ja vältigeaspireerige hõljuv valge sade.
Δ Lisage puhvrit P4 ja pöörake kohe ümber, et hästi seguneda.Laske katseklaasil seista, kuni valge sade on kogu lahuses ühtlaselt jaotunud, et vältida lokaalse sademete teket, mis võib mõjutada neutraliseerimist.Kui enne tsentrifuugimist pole ühtlast valget helbest sadet ja supernatant ei ole pärast tsentrifuugimist selge, võib katseklaasitsentrifuugitakse veel 5 minutit.
5. Lisage etapis 4 saadud supernatandile 0,1-kordne maht (10% supernatandi mahust, umbes 2,2 ml) Endotoxin Scavengerit ja segage ümber.Asetage lahus jäävanni või asetage purustatud jäässe (või külmikusse sügavkülmikusse) 5 minutiks, kuni lahus muutub hägusest selgeks ja läbipaistvaks (või jääb paigale).kergelt hägune) ja sega aeg-ajalt mitu korda.
Δ Pärast endotoksiini püüduri lisamist supernatandile muutub supernatant häguseks, kuidsupernatant peaks pärast jäävannis jahutamist muutuma selgeks (või kergelt häguseks).
6. Pärast seda, kui supernatant on asetatud 10–15 minutiks toatemperatuurile (>25 ℃), muutub see häguseks.selle temperatuur tõuseb toatemperatuurini.Seejärel tuleb supernatant segamiseks ümber pöörata.
Δ Kui toatemperatuur on madalam või soovite ekstraheerimisaega lühendada, võib supernatanti inkubeerida 37–42 ℃ veevannis 5–10 minutit ja järgmise etapi võib läbi viia pärast supernatanti.muutub häguseks.
7. Faasi eraldamiseks tsentrifuugige supernatanti kiirusel umbes 11 000 p/min (12 000 × g) 10 minutit toatemperatuuril (temperatuur peab olema >25 ℃).Ülemine vesifaas sisaldab DNA-d, samas kui alumine sinine õlifaasi kiht sisaldab endotoksiini ja muid lisandeid.Viige üleDNA-d sisaldav vesifaas uude tuubi javisake õline kiht ära.
Δ Temperatuur tsentrifuugimise ajal peab olema üle 25 ℃, kuna efektiivne faaside eraldamine seda ei teetekkida, kui temperatuur on liiga madal.
Δ Kui faaside eraldamine ei ole efektiivne, saab tsentrifuugimise temperatuuri reguleerida 30 ℃-ni jatsentrifuugimise aega saab pikendada 15 minutini.
Δ Ärge imege sinist õlikihti, kuna see sisaldab endotoksiini ja muid lisandeid.
mehhanism
Resuspendeerimine Lüüsi neutraliseerimine
◇ Lisage 7,5 ml puhvrit P1
◇ Lisage 7,5 ml puhvrit P2
◇ Lisage 7,5 ml puhvrit P4
Endotoksiinide eemaldamine
◇ Lisage 0,1 korda suurem Endotoxin Scavengeri supernatandi maht
Köitmine ja pesemine
◇ Lisage 0,5-kordne maht isopropanooli
◇ Lisage 10 ml puhvrit PW
◇ Lisage 10 ml puhvrit PW
Elueerimine
◇ Lisage 1–2 ml TB puhverlahust või endotoksiinivaba ddH2O
