M-MLV Neoscripti pöördtranskriptaas
Neoscripti pöördtranskriptaas on pöördtranskriptaas, mis on saadud Moloney hiire leukeemiaviiruse päritolu M-MLV geeni mutatsiooni skriinimisel ja ekspressioonil E. colis.Ensüüm eemaldab RNaas H aktiivsuse, talub kõrgemat temperatuuri ja sobib kõrgel temperatuuril pöördtranskriptsiooniks.Seetõttu on see kasulik RNA kõrgetasemelise struktuuri ja mittespetsiifiliste tegurite ebasoodsate mõjude kõrvaldamiseks cDNA sünteesile ning sellel on suurem stabiilsus ja pöördtranskriptsiooni sünteesivõime.Ensüümil on suurem stabiilsus ja pöördtranskriptsiooni sünteesivõime.
Komponendid
1.200 U/μL Neoscripti pöördtranskriptaas
2.5 × esimese ahela puhver (valikuline)
* 5 × esimese ahela puhver ei sisalda dNTP-d, lisage reaktsioonisüsteemi ettevalmistamisel dNTP-d
Soovitatav rakendus
1.Üheastmeline qRT-PCR.
2.RNA viiruse tuvastamine.
Ladustamise seisukord
-20°C pikaajaliseks säilitamiseks, tuleb enne kasutamist korralikult läbi segada, vältida sagedast külmutamist-sulatamist.
Ühiku määratlus
Üks ühik sisaldab 1 nmol dTTP-d 10 minuti jooksul temperatuuril 37 °C, kasutades polü(A)•oligo(dT)25mallina/praimerina.
Kvaliteedi kontroll
1.SDS-PAGE elektroforeetiline puhtus on suurem kui 98%.
2.Võimendi tundlikkus, partii-partii juhtimine, stabiilsus.
3.Puudub eksogeenne nukleaasi aktiivsus, eksogeense endonukleaasi või eksonukleaasi saastumine
Esimese ahelreaktsiooni lahenduse reaktsiooniseadistus
1.Reaktsioonisegu valmistamine
| Komponendid | Helitugevus |
| Oligo(dT)12-18 Kruntvärv või Random Primera Või geenispetsiifilised praimeridb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Malli RNA | Kogu RNA≤ 5 μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNaasivaba dH2O | 10 μL-ni |
Märkused:a/b: palun valige erinevat tüüpi praimerid vastavalt oma katsevajadustele.
2.Kuumutage 65 °C juures 5 minutit ja jahutage kiiresti jääl 2 minutit.
3.Lisage ülaltoodud süsteemile järgmised komponendid kogumahuni 20 µL ja segage õrnalt:
| Komponendid | Helitugevus (μL) |
| 5 × esimese ahela puhver | 4 |
| Neoscripti pöördtranskriptaas (200 U/μL) | 1 |
| RNaasi inhibiitor (40 U/μL) | 1 |
| RNaasivaba dH2O | Kuni 20 μL |
4. Viige reaktsioon läbi vastavalt järgmistele tingimustele:
(1) Kui kasutatakse juhuslikku praimerit, tuleb reaktsioon läbi viia temperatuuril 25 ℃ 10 minutit ja seejärel temperatuuril 50 ℃ 30–60 minutit;
(2) Kui kasutatakse Oligo dT või spetsiifilisi praimereid, tuleb reaktsioon läbi viia temperatuuril 50 ℃ 30–60 minutit.
5.Neoscripti pöördtranskriptaasi inaktiveerimiseks ja reaktsiooni peatamiseks kuumutage 95 ℃ juures 5 minutit.
6.Pöördtranskriptsiooni saadusi saab kasutada otse PCR reaktsioonis ja fluorestsents-kvantitatiivses PCR reaktsioonis või säilitada -20 ℃ juures pikka aega.
PCR Rtegevus:
1.Reaktsioonisegu valmistamine
| Komponendid | Keskendumine |
| 10 × PCR puhver (dNTP-vaba, Mg²+ vaba) | 1× |
| dNTP-d (10 mM iga dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polümeraas (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Praimer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Praimer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Malla | ≤10% esimese ahelreaktsiooni lahus (2 μL) |
| ddH2O | Kuni 50 μl |
Märkused:a: Kui lisatakse liiga palju esimese ahelreaktsiooni lahust, võib PCR reaktsioon olla pärsitud.
2.PCR reaktsiooni protseduur
| Samm | Temperatuur | Aeg | Tsüklid |
| Eeldenatureerimine | 95℃ | 2-5 minutit | 1 |
| Denatureerimine | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Lõõmutamine | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Laiendus | 72℃ | 10-60 sek |
Märkmed
1.Sobib pöördtranskriptsiooni temperatuuri optimeerimiseks vahemikus 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Sellel on parem stabiilsus, see sobib kõrgel temperatuuril pöördtranskriptsiooni võimendamiseks.Lisaks on see soodne RNA keerukate struktuursete piirkondade tõhusaks läbimiseks.Samuti seesobib üheetapilise multipleksfluorestsentsi kvantitatiivseks RT-PCR tuvastamiseks.
3.Hea ühilduvus erinevate PCR amplifikatsiooni ensüümidega ja sobib kõrge tundlikkusega RT-PCR reaktsioonide jaoks.
4.Sobib kõrge tundlikkusega üheastmelise fluorestsents-kvantitatiivse RT-PCR reaktsiooni jaoks, parandades tõhusalt matriitsi madala kontsentratsiooni tuvastamise kiirust.
5.Sobib cDNA raamatukogu ehitamiseks.
