DNA ekstraheerimise minikomplekt
See komplekt kasutab optimeeritud puhversüsteemi ja silikageelkolonni puhastamise tehnoloogiat, mis suudab taastada 70 bp–20 kb DNA fragmente erinevatest kontsentratsioonidest TAE või TBE agaroosgeelist.DNA adsorptsioonikolonn suudab DNA-d spetsiaalselt adsorbeerida kõrge soolasisaldusega tingimustes.Lisaks saab komplektiga otse puhastada DNA fragmente PCR saadustest, ensümaatilistest reaktsioonisüsteemidest või muude meetoditega saadud DNA toorproduktidest ning eemaldada lisandeid, nagu valgud, muud orgaanilised ühendid, anorgaanilised soolaioonid ja oligonukleotiidpraimerid.See võib tagada, et puhastamine saab lõpule viia 10-15 minuti jooksul.Puhastatud DNA-d saab kasutada otse ligeerimiseks, transformeerimiseks, ensüümi seedimiseks, in vitro transkriptsiooniks, PCR-iks, sekveneerimiseks, mikroinjektsiooniks jne.
Säilitustingimused
Hoida temperatuuril -15 ~ -25 ℃ ja transportida toatemperatuuril.
Komponendid
| Komponendid | (100 rxns) |
| Puhver SKT | 80 ml |
| Puhver GW | 2 × 20 ml |
| Elueerimispuhver | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Puhver SKT:DNA sidumispuhver.
GW puhver:Pesupuhver;enne kasutamist lisage pudelil näidatud koguses absoluutset etanooli.
Elueerimispuhver:Elueerimine.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA adsorptsiooni kolonnid.
Kogumistuubid 2 ml:Filtraadi kogumistorud.
Ettevalmistatud materjalid
1,5 ml steriliseeritud tuubid, absoluutne etanool ja isopropanool (kui DNA fragment ≤100 bp, lisage 1 maht
isopropanool kuni 1 mahu geelini), veevann.
Katseprotsess
Enne kasutamist lisage 80 ml etanooli, et lahjendada puhvrit GW, nagu näidatud sildil, ja hoida toatemperatuuril.
mehhanism
1. PCR reaktsioonilahus
Geeli ekstraheerimise skeem: lisage võrdne maht puhvri GDP PCR reaktsioonilahuse taastamise skeem:Lisage 5-kordne mahupuhver
2. SKT Arvutage geeli maht (100 μl võrdub 100 mg)
Lahustage geel
3. Eelsoojendage 50-55 kraadini℃
4. Bind Wash
Lisage 300 μL puhvrit SKT*
Lisage 700 μL puhvrit GW
Lisage 700 μL puhvrit GW
5. Elute
Lisage 20–30 μL elueerimispuhvrit või deioniseeritud vett
Märkused* PCR reaktsioonivedeliku taastamine ilma selle etapita
Geeli ekstraheerimise programm
1. Pärast DNA elektroforeesi DNA fragmentide fraktsioneerimiseks lõigake agaroosgeelist UV-valguses välja üksik DNA fragmendi riba.Soovitatav on kasutada imavat paberit, et imada geeli näiv niiskus ja minimeerida geelilõigu suurust, eemaldades nii palju kui võimalik üleliigne agaroos.Kaaluge geeliviilu (ilma mikrotsentrifuugitoruta), et arvutada selle maht: 100 mg geeliviilu maht on ligikaudu 100 μL, eeldades, et tihedus on 1 g/ml.
2. Lisage võrdne kogus puhvrit GDP, inkubeerige temperatuuril 50–55 ℃ 7-10 minutit (sõltuvalt geeli suurusest reguleerige inkubatsiooniaega, kuni geel on täielikult lahustunud).Inkubeerimise ajal keerake toru 2 korda ümber.
Δ 1-3 mahu puhvri SKT lisamine ei mõjuta DNA taastamise efektiivsust.Kui taastatav DNA fragment <100 bp, tuleb lisada 3 mahtu puhvrit GDP;kui geelilõik on täielikult lahustunud, lisage 1 mahuosa isopropanooli ja segage hoolikalt, seejärel jätkake järgmise sammuga.
3. Tsentrifuugige lühidalt, et viia proov katseklaasi põhja, sisestage FastPure DNA Mini Columns-G 2 ml kogumistuubidesse, kandke lahust ettevaatlikult maksimaalselt 700 μl üks kord
aeg filtreerimiskolonnidesse, tsentrifuugige kiirusel 12 000 p/min (13 800 x g) 30-60 sekundit.
4. Visake filtraat ära ja lisage kolonni 300 μL puhvrit GDP, inkubeerige toatemperatuuril 1 min, tsentrifuugige kiirusel 12 000 p/min (13 800 X g) 30–60 sekundit.
5. Visake filtraat ära ja lisage kolonni 700 μL puhvrit GW (kontrollige, kas absoluutset etanooli on eelnevalt lisatud!), tsentrifuugige 12 000 p/min (13 800 X g) juures 30–60 sekundit.
Δ Lisage puhver GW ümber adsorptsioonikolonni seina või lisage puhver GW tagakaane ja segage seda tagurpidi 2–3 korda, et aidata toru seinale kleepuvat soola täielikult loputada.
6. Korrake 5. sammu.
Δ Puhvriga GW kaks korda loputamine võib tagada soola täieliku eemaldamise ja kõrvaldada selle mõju järgnevatele katsetele.
7. Visake filtraat ära ja tsentrifuugige tühja kolonni kiirusel 12 000 p/min (13 800 X g) 2 minutit.
8. Sisestage kolonn puhtasse 1,5 ml mikrotsentrifuugi katsutisse, lisage kolonni membraani keskele 20–30 μL elueerimispuhvrit, inkubeerige 2 minutit ja seejärel tsentrifuugige kiirusel 12 000 p/min (13 800 X g) 1 minut.Visake kolonn ära, säilitage saadud DNA -20 °C juures.
Etapi 8 supernatandi ülekandmine kolonni, et elueerida uuesti, ja elueerimispuhvri eelkuumutamine temperatuurini 55 (kui DNA fragment >3 kb) võib olla abiks taaskasutamise efektiivsuse suurendamiseks.
PCR-toodete taastamise programm
See protokoll on rakendatav DNA fragmentide puhastamiseks PCR produktidest, ensümaatilisest reaktsioonisüsteemist ja muudest DNA toorproduktidest (sealhulgas geneetiline DNA).See lahus võib tõhusalt eemaldada mitmesuguseid nukleotiide, praimereid, praimerite dimeere, soolamolekule, ensüüme ja muid lisandeid.
1. Tsentrifuugige lühidalt PCR-produkte, ensümaatilise reaktsiooni lahust ja muid DNA toorprodukte.Hinnake nende mahtu pipetiga ja kandke steriliseeritud 1,5 ml või 2 ml tuubi.Lisage ddH2O, kuni maht on 100 μL;samas kui kõrge kontsentratsiooniga genoomse DNA puhul aitab ddH2O-ga lahjendamine 300 μL-ni parandada taastumise efektiivsust.
2. Lisage 5 mahtu puhvrit GDP, segage hoolikalt ümberpööramise või keerise abil.Kui huvipakkuv DNA fragment >100 bp, tuleb lisada veel 1,5 mahtu (proovid + puhvri SKT) etanooli.
3. Sisestage kolonn tagasi kogumistorusse, viige segu kolonni, tsentrifuugige 12 000 pööret minutis (13 800 × g) 30–60 sekundit.Kui segatud lahuse maht on >700 µL, asetage adsorptsioonikolonn tagasi kogumiskatsuti, kandke järelejäänud lahus adsorptsioonikolonni ja tsentrifuugige kiirusel 12 000 p/min (13 800 × g) 30–60 sekundit.
4. Järgmine toiming viitab 08-1/geeli ekstraheerimisprogrammi sammudele 5–8.
Rakendused
TAE või TBE agaroosgeeli erinevad kontsentratsioonid;PCR-produktid, ensümaatilised reaktsioonisüsteemid või muud erinevate meetoditega saadud DNA toorproduktid.Taastatud killud ulatusid vahemikus70 bp - 20 kb.
Märkmed
Ainult teaduslikuks kasutamiseks.Mitte kasutada diagnostilistes protseduurides.
1. Enne kasutamist lisage puhvri GW lahjendamiseks 80 ml etanooli, nagu märgitud sildil, ja hoidke toatemperatuuril.
2. Kui puhver-SKT-d on madalal temperatuuril säilitamise ajal kerge sadestada, võib selle enne kasutamist mõneks ajaks toatemperatuurile panna.Vajadusel võib seda eelkuumutada 37 ℃ veevannis, kuni sade on täielikult lahustunud, ja seejärel pärast segamist kasutada.
3. Seadke veevanni temperatuur eelnevalt 50 ~ 55 ℃ peale.
4. 08-1/Gel ekstraktsiooniprogrammi 1. etapis vähendab geelilõigu suuruse minimeerimine oluliselt lahustumisaega ja suurendab taastumise efektiivsust (lineariseeritud DNA on kergesti hüdrolüüsitav, kui seda pidevalt kõrgel temperatuuril eksponeerida).Ärge jätke DNA geeli pikaks ajaks UV-kiirgusele, kuna ultraviolettvalgus võib DNA-d kahjustada.
5. Lahustage geel 08-1/geeli ekstraheerimisprogrammi 2. etapis täielikult, vastasel juhul mõjutab see tõsiselt DNA taastamise efektiivsust.
6. Eelsoojendage elueerimispuhver või ddH2O temperatuurini 55 ℃, mis aitab parandada DNA elueerimise efektiivsust.DNA-d on soovitatav säilitada 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5 eluendis.
