Warm Start Bst 2.0 DNA polümeraas (glütseroolivaba)
Bst DNA polümeraas V2 pärineb Bacillus stearothermophilus DNA polümeraasist I, millel on 5′→3′ DNA polümeraasi aktiivsus ja tugev ahela asendusaktiivsus, kuid puudub 5′→3′ eksonukleaasi aktiivsus.Bst DNA polümeraas V2 sobib ideaalselt ahela nihutamiseks, isotermiliseks amplifikatsiooniks LAMP (loop mediated isothermal amplification) ja kiireks sekveneerimiseks.Bst DNA polümeraas V2 on kuumkäivitusega versioon, mis põhineb Bst DNA polümeraasil V2 (HC5005A), mis on saadud pöörduva modifikatsioonitehnoloogia abil ja mis võib inhibeerida DNA polümeraasi aktiivsust toatemperatuuril, nii et reaktsioonisüsteemi saab kasutada ja formuleerida toatemperatuuril, et vältida -spetsiifiline võimendamine ja reaktsiooni efektiivsuse parandamine ning seda versiooni saab lüofiliseerida.Lisaks vabaneb selle aktiivsus kõrgel temperatuuril, mistõttu ei ole vaja eraldi aktiveerimisetappi.
Komponendid
| Komponent | HC5006A-01 | HC5006A-02 | HC5006A-03 |
Bst DNA polümeraas V2 (glütseroolivaba) (8U/μL) | 0,2 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC Bst V2 puhver | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 2 × 10 ml |
Rakendused
1.LAMP isotermiline võimendus
2.DNA ahela ühe nihke reaktsioon
3.Kõrge GC geenijärjestus
4.DNA järjestuse määramine nanogrammi tasemel.
Ladustamise seisukord
Transportida temperatuuril alla 0°C ja hoida temperatuuril -25°C~-15°C.
Ühiku määratlus
Üks ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis lisab 25 nmol dNTP-d happes lahustumatusse ainesse 30 minuti jooksul temperatuuril 65 °C.
Kvaliteedi kontroll
1.Valgu puhtuse test (SDS-PAGE):Bst DNA polümeraasi V2 puhtus on ≥99% määratud SDS-PAGE analüüsiga, kasutades Coomassie Blue detekteerimist.
2.EndonukleaasTegevus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 μl reaktsioonisegu inkubeerimine 1 μg λDNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
3.Eksonukleaasi aktiivsus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 μl reaktsioonisegu inkubeerimine 1 μg λ-Hind Ⅲ lõhutud DNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
4.Nickase tegevus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 µl reaktsioonisegu inkubeerimine 1 µg pBR322 DNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
5.RNaasi aktiivsus:Vähemalt 8 U Bst DNA polümeraasi V2 sisaldava 50 μl reaktsioonisegu inkubeerimine 1,6 μg MS2 RNA-ga 16 tundi temperatuuril 37 °C ei põhjusta tuvastatavat lagunemist.
6.E. coliDNA:120 U Bst DNA polümeraasi V2 skriinitakse E. coli genoomse DNA olemasolu suhtes, kasutades TaqMan qPCR koos E. coli 16S rRNA lookuse suhtes spetsiifiliste praimeritega.E. coli genoomse DNA saastumine on ≤1 koopia.
LAMP Reaktsioon
| Komponendid | 25μL |
| 10 × HC Bst V2 puhver | 2,5 μL |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL |
| dNTP-d (igaüks 10 mM) | 3,5 μL |
| SYTO™ 16 roheline (25×)a | 1,0 μL |
| Praimeri segub | 6 μL |
| Bst DNA polümeraas V2 (glütseroolivaba) (8 U/uL) | 1 μL |
| Mall | × μL |
| ddH₂O | Kuni 25 μL |
Märkused:
1) a.SYTOTM 16 Green (25×): Vastavalt eksperimentaalsele vajadusele võib asendusainetena kasutada ka teisi värvaineid;
2) b.Praimeri segu: saadakse 20 uM FIP, 20 uM BIP, 2,5 uM F3, 2,5 uM B3, 5 uM LF, 5 uM LB ja muude mahtude segamisel.
Reaktsioon ja seisund
1 × HC Bst V2 puhvriga, inkubatsioonitemperatuur on vahemikus 60 °C kuni 65 °C.
Kuumuse inaktiveerimine
80°C, 20 min
