Uratsiili DNA glükosülaas
Uratsiil-DNA glükosülaas (UNG või UDG) on E.coli rekombinantne kloon molekulmassiga 25 kDa.See katalüüsib vaba uratsiili vabanemist uratsiili sisaldavast ühe- ja kaheahelalisest DNA-st ning on RNA suhtes inaktiivne ning seda saab kasutada PCR amplifikatsiooniproduktide saastumise vältimiseks.Toime põhimõte põhineb asjaolul, et kui PCR reaktsioonis asendatakse dTTP dUTP-ga ja tekib dU-aluseid sisaldav PCR-i amplifikatsiooniprodukt, suudab ensüüm U-aluste glükosiidsideme selektiivselt lõhkuda ühe- ja kaheahelalistes. DNA ja lagundavad PCR amplifikatsiooniprodukti.
Soovitatav rakendus
Saastumise vältimise võimendamine
Ladustamise seisukord
-20°C pikaajaliseks säilitamiseks, tuleb enne kasutamist korralikult läbi segada, vältida sagedast külmutamist-sulatamist.
Salvestuspuhver
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilisaator, 50% glütserool.
Ühiku määratlus
Ensüümi kogus, mis on vajalik 1 µg dU-aluseid sisaldava üheahelalise DNA lagundamiseks 1 tunni jooksul temperatuuril 37 °C, on 1 ühik.
Kvaliteedi kontroll
1.SDS-PAGE elektroforeetiline puhtus üle 98%
2.Võimendi tundlikkus, partii-partii juhtimine, stabiilsus
3.Pärast 1 U UNG töötlemist temperatuuril 50 ℃ 2 minutit peaks mall, mis sisaldab U alla 103 koopiat, täielikult lagunema ja võimendusprodukti ei saa tekkida.
4.Eksogeense nukleaasi aktiivsus puudub
Juhised
| Komponendid | Maht (μL) | Lõplik kontsentratsioon |
| 10 × PCR puhver (dNTP-vaba, Mg²+tasuta) | 5 | 1× |
| dUTP-d (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (asenda dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1–0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × krunt segua | 2 | 1× |
| Mall | - | ＜1μg/reaktsioon |
| ddH₂O | 50-ni | - |
Märge: a: Kui seda kasutatakse qPCR/qRT-PCR jaoks, tuleb fluorestsentssond lisada reaktsioonisüsteemi.Tavaliselt võib praimeri lõppkontsentratsioon 0,2 μM anda häid tulemusi;kui reaktsioon on halb, saab praimeri kontsentratsiooni reguleerida vahemikus 0,2-1 μM.Tavaliselt on sondi kontsentratsioon optimeeritud vahemikus 0,1–0,3 μM.Praimeri ja sondi parima kombinatsiooni leidmiseks võib läbi viia kontsentratsioonigradiendi katseid.
Märkmed
1.UNG ensüümi saab kasutada saastunud dUTP amplifikatsiooniproduktide eemaldamiseks reaktsioonisüsteemist enne PCR amplifikatsioonireaktsiooni, et vältida toote saastumisest tingitud valepositiivseid tulemusi.
2.Saastumisevastases PCR-reaktsioonis kasutatava UNG ensüümi optimaalne temperatuur on tavaliselt 50 ℃ 2 minuti jooksul;inaktiveerimise tingimus on 95 ℃ 5 minuti jooksul.
3.Vältige sagedast külmutamist-sulatamist ja ärge laske end kokku puutuda suurte temperatuurikõikumistega.
4.Erinevatel amplifitseeritavatel geenidel on erinev dUTP kasutusefektiivsus ja tundlikkus UNG ensüümi suhtes, mistõttu kui UNG süsteemi kasutamine toob kaasa tuvastamise tundlikkuse vähenemise, tuleks reaktsioonisüsteemi reguleerida ja optimeerida, tehnilise toe vajaduse korral võtke ühendust meie firma.
