Plant direct PCR Kit

Kassi nr: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit sobib taimede lehtede, seemnete jms otseseks amplifitseerimiseks ning seda saab kasutada polüsahhariide ja polüfenoole mittesisaldavate taimeproovide suure läbilaskevõimega sõelumiseks.Suunatud evolutsioonil põhinev otsese amplifikatsiooniga DNA polümeraas talub taimedes PCR inhibiitoreid paremini.Samal ajal säilitab see kõrge amplifikatsioonivõime, mis sobib DNA fragmentide amplifitseerimiseks 5 kb piires.Komplektis olevat ainulaadset lüüsipuhvrit A saab kasutada värskete või külmutatud taimekudede lüüsimiseks.Seda on lihtne kasutada ja lüsaati saab kasutada ilma puhastamiseta amplifikatsiooni mallina.Süsteem sisaldab kaitseaineid, mis võimaldavad toorproove pärast korduvat külmutamist ja sulatamist tõhusalt amplifitseerida.2 × Plant Direct Master Mix peab amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks lisama ainult praimereid ja malle, vähendades sellega pipeteerimistoiminguid ning parandades tuvastamise läbilaskevõimet ja tulemuste reprodutseeritavust.

Komponendid

*Plant Direct Lysis Buffer B on valikuline reagent, mida kasutatakse Plant Direct Lysis Buffer A neutraliseerimiseks proovide säilitusaja pikendamiseks.Seda saab kasutada vastavalt tegelikule olukorrale.

Säilitamistingimused

2 × Plant Direct Master Mix, säilita -30 ~ -15 ℃ ja vältige korduvat külmutamist ja sulatamist;Plant Direct Lysis Buffer, hoida temperatuuril -30 ~ -15 ℃ või 2 ~ 8 ℃.

Katseprotsess

Proovide töötlemine–Taime Leht

Otsene meetod:Soovitatav on kasutada noori lehti.Kasutage väikese ja ühtlase proovi saamiseks fikseeritud läbimõõduga 0,5–3 mm augurauda ja seejärel lisage proov otse PCR-süsteemi (soovitatav on 50 μl süsteem).Pange tähele, et proov on PCR-i lahuses, mitte vastu katseklaasi.Kui pikkade fragmentide ja komplekssete proovide amplifitseerimiseks kasutatakse otsest PCR-i, võib väiksema läbimõõduga (0,5–1 mm) proovi kasutamine matriitsina aidata saada paremaid tulemusi.

Lihvimise lüüsi meetod:Soovitatav on kasutada noori lehti.Võtke väike tükk lehest (umbes 1–3 mm läbimõõduga), asetage see 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab-i ja jahvatage seda nii palju kui võimalik (selle sammu saab teha, pigistades lehte 100 μl pipetiotsaga proovi purustamiseks) .Kui kasutatakse suuremaid lehekoe mahtusid (mitte üle 7 mm), suurendage lahjenduspuhvri mahtu 50 μl-ni.Pärast lehtede jahvatamist peaks lahus olema roheline.Pärast lühikest tsentrifuugimist lisage reaktsioonimatriitsina PCR-süsteemi 1 μl supernatanti.

Termilise lüüsi meetod:Soovitatav on kasutada noori lehti.Võtke väike tükk lehest (umbes 1–3 mm läbimõõduga), asetage see 20 μl Plant Direct Lüüsi puhvrisse A ja kuumutage 95 °C juures 5–10 minutit.Raskesti lüüsitavate lehtede puhul saab lüüsiaega sobivalt pikendada (mitte rohkem kui 20 min).Kui kasutatakse suuremaid lehekoe mahtusid (mitte üle 7 mm), suurendage lahjenduspuhvri mahtu 50 μl-ni.Pärast kuumutamist tsentrifuugige lühidalt ja lisage reaktsioonimatriitsina PCR-süsteemi 1 μl supernatanti.

Proovide töötlemine- Taime seeme

Lihvimise lüüsi meetod:Lõigake skalpelliga 5 mm läbimõõduga seemned, lisage need 100 μl Plant Direct Lysis puhvrile A ja jahvatage proov pipetiotsa või muude tööriistadega.Segage korraks vorteksiga ja laske 3–5 minutit toatemperatuuril seista.Veenduge, et seemneproov oleks lahjenduspuhvris sukeldatud.Pärast lühikest tsentrifuugimist lisage reaktsioonimatriitsina PCR-süsteemi 1 μl supernatanti.

Termilise lüüsi meetod:Lõigake skalpelliga 5 mm läbimõõduga seemned, lisage need 100 μl Plant Direct Lüüsi puhvrile A ja kuumutage 95°C juures 5–10 minutit.Raskesti lüüsitavate lehtede puhul saab lüüsiaega sobivalt pikendada (mitte rohkem kui 30 min).Pärast kuumutamist tsentrifuugige lühidalt ja lisage reaktsioonimatriitsina PCR-süsteemi 1 μl supernatanti.

a.Sobiva suurusega proovide lõikamiseks võib kasutada ka kääre või muid tööriistu;kui stantsi või kääre kasutatakse uuesti, tuleb neid enne iga kasutamist puhastada 2% naatriumhüpokloriti lahusega, et vältida proovide vahelist ristsaastumist.

b.Enne kasutamist veenduge, et Plant Direct Lysis Buffer on täielikult sulanud.Kui puhver on viskoosne või sisaldab sadet, võib seda enne kasutamist kuumutada temperatuuril 37 ℃, et see täielikult sulaks.

c.Matriitsi mahtu reaktsioonisüsteemis saab vastavalt taimse materjali ja lisatud lahjendi mahu erinevusele vastavalt reguleerida.

Taime otselüüsipuhver

Selles tootes sisalduv Plant Direct Lysis Buffer A on rangelt optimeeritud vabastama enamiku taimekudede genoomi ja sobib toortaimede lühiajaliseks säilitamiseks temperatuuril 4 ℃.Kui proovi on vaja pikemat aega (nt 1–2 kuud) säilitada, on soovitatav supernatant üle viia uude EP katsutisse ja hoida temperatuuril -20 ℃.Proovide stabiilsemaks säilitamiseks lisage ülekantud supernatandile võrdne kogus Plant Direct Lysis Buffer B, segage hästi ja säilitage temperatuuril -20 ℃.Stabiilne säilitusaeg sõltub taimeproovidest ja olekutest.

Reaktsioonisüsteem

a.See sisaldab Mg²⁺lõppkontsentratsioonil 2 mM.

b.Soovitatav on kasutada iga praimeri lõppkontsentratsiooni 0,4 μM.Praimerite liigne kasutamine suurendab mittespetsiifilist amplifikatsiooni.

c.Kasutatava proovi kogust saab kohandada vastavalt tegelikule olukorrale.Ühes reaktsioonis kasutatavat lüüsitud toorproovi kogust saab reguleerida vahemikus 2–20% reaktsiooni kogumahust.Liiga suure hulga proovide kasutamine võib põhjustada võimendustõrke.

Reaktsiooniprogramm

a.Esialgne denatureerimine (98 ℃, 5 min) soodustab taimekoe lüüsi, vabastades genoomse DNA, mida saab kasutada PCR amplifikatsiooniks.Ärge lühendage aega ega vähendage temperatuuri.

b.Soovitatav on seada see võrdseks praimeri Tm väärtusega või 2 ~ 4 ℃ võrra kõrgemaks kui Tm väärtus.Selles tootes kasutatav otsese amplifikatsiooniga DNA polümeraas erineb tavapärasest Taq DNA polümeraasist ja sellel on erinõuded reaktsiooni anniilimistemperatuurile ； Kõrge anniilimistemperatuuri kasutamine võib tõhusalt vähendada mittespetsiifilist amplifikatsiooni ja parandada amplifikatsiooni efektiivsust.Keeruliste mallide puhul saab tõhusa võimenduse saavutada lõõmutamistemperatuuri reguleerimise ja pikendamisaja pikendamise abil.

c.Kui võimendusprodukti pikkus on ≤1 kb, määratakse pikendusajaks 30 sek/kb;kui võimendusprodukti pikkus on >1 kb, määratakse pikendusajaks 60 sek/kb.

d.Kompleksproovide või madala amplifikatsioonisaagisega proovide puhul saab tsüklite arvu suurendada 40–50 tsüklini.

Rakendused

Seda saab kasutada taimekudede otseseks amplifitseerimiseks ja polüsahhariide ja polüfenoole mittesisaldavate taimeproovide suure läbilaskevõimega sõelumiseks.

Märkmed

Ainult teaduslikuks kasutamiseks.Mitte kasutada diagnostilistes protseduurides.

1. Toortaimede amplifikatsiooni või otsese amplifikatsiooni korral on soovitatav enne katse alustamist kasutada positiivse kontrollina puhastatud genoomset DNA-d, et tagada süsteemi, praimerite ja operatsioonide õigsus.

2. Selles komplektis kasutatud otsesel amplifikatsiooni DNA polümeraasil on tugev korrektuur.Kui on vaja läbi viia TA kloonimine, on soovitatav DNA enne adeniini lisamist puhastada.

3. Krundi kujundamise juhend:

a.Soovitatav on, et viimane alus kruntvärvi 3′ otsas oleks G või C.

b.Vältida tuleks järjestikuseid ebakõlasid praimeri 3′ otsas olevas viimases 8 aluses.c.Vältige juuksenõelastruktuure krundi 3′ otsas.

d.Erinevused päri- ja vastupidise praimeri Tm väärtuses ei tohi olla suuremad kui 1 ℃ ja Tm väärtus tuleks reguleerida 60 ~ 72 ℃ peale (Tm väärtuse arvutamiseks on soovitatav kasutada Primer Premier 5).

e.Praimeri Tm väärtuse arvutamisel ei tohiks kaasata täiendavaid täiendavaid praimerite järjestusi, mis ei kattu malliga.

f.Soovitav on, et kruntvärvi GC sisaldus oleks 40% -60%.

g.A, G, C ja T üldine jaotus praimeris peaks olema võimalikult ühtlane.Vältige kõrge GC- või AT-sisaldusega piirkondade kasutamist.

h.Vältige 5 või enama aluse komplementaarsete järjestuste olemasolu kas praimeris või kahe praimeri vahel ja vältige 3 või enama aluse komplementaarsete järjestuste olemasolu kahe praimeri 3'-otsas.

i.Kasutage praimeri spetsiifilisuse kontrollimiseks funktsiooni NCBI BLAST, et vältida mittespetsiifilist amplifikatsiooni.