M-MLV pöördtranskriptaas
RevScripti pöördtranskriptaas saadakse geenitehnoloogia tehnoloogia abil.Sellel on suurem cDNA sünteesivõime, termiline stabiilsus ja reaktsioonitemperatuuri piir (kuni 60 °C).Sünteesitud cDNA saadus on kuni 10 kb.See suurendab mallide afiinsust ja sobib keeruka sekundaarse struktuuriga või vähese koopiaga geenidega RNA matriitsi pöördtranskriptsiooniks.
Komponendid
| Komponent | HC2003B-01 (10 000 U) | HC2003B-02 (5*10 000U) | HC2003B-03 (200 000 U) |
| RevScripti pöördtranskriptaas (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScripti puhver | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Ladustamise seisukord
Seda toodet tuleb hoida temperatuuril -25°C ~ -15°C 2 aastat.
Ühiku määratlus
Üks ühik sisaldab 1 nmol dTTP-d happes lahustumatusse materjali 10 minuti jooksul temperatuuril 37 °C, kasutades praimeritena Oligo(dT).
Reaktsiooni seadistamine
1. RNA matriitsi denatureerimine (See samm on valikuline, RNA matriitsi denatureerimine aitab avada sekundaarstruktuure, mis parandab esimese ahela cDNA saagist.)
| Komponendid | Helitugevus (μL) |
| RNaasi vaba ddH2O | 13-ni |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) või Random Primer (50 μmol/L) Või geenispetsiifilised praimerid (2 μmol/L) | 1 |
| või 1 | |
| või 1 | |
| RNA matriits | Xa |
Märkused:
1) a: kogu RNA: 1-5 ug või mRNA: 1-500 ng
2) Inkubeerimine temperatuuril 65 °C 5 minutit, seejärel viimine kohe jääle 2 minutiks jahtuma.Lühike tsentrifuugimine reaktsioonivedeliku kogumiseks, lisage pöördtranskriptsiooni reaktsiooni lahus, nagu on näidatud järgmises tabelis.Pipeteerige õrnalt segamiseks.
1. Reaktsioonisegu valmistamine (maht 20 μL)
| Komponendid | Helitugevus (μL) |
| Eelmise etapi segu | 13 |
| 5 × puhver | 4 |
| dNTP segu (10 nmol/l) | 1 |
| Pöördtranskriptaas (200 U/μL) | 1 |
| RNaasi inhibiitor (40 U/μL) | 1 |
1.Viige reaktsioon läbi järgmistel tingimustel:
| Temperatuur (°C) | Aeg |
| 25 °Ca | 5 minutit |
| 42 °Cb | 15-30 minutit |
| 85 °Cc | 5 minutit |
Märkused:
1) a.Inkubeerimine temperatuuril 25 °C 5 minutit on vajalik ainult juhuslike heksameeride kasutamiseks.Palun jätke see samm vahele, kui kasutate Oligot (dT)18või geenispetsiifiline praimer.
2) b.Soovitatav pöördtranskriptsiooni temperatuur on 42°C. Keerulise sekundaarse struktuuriga või suure GC sisaldusega mallide puhul on soovitatav tõsta reaktsioonitemperatuur 50-55°C-ni.
3) c.Kuumutamine 85 °C juures 5 minutit, et inaktiveerida pöördtranskriptaasi.
4) Toodet saab vahetult kasutada PCR või qPCR reaktsioonides või säilitada lühiajaliseks säilitamiseks temperatuuril -20 °C.Pikaajaliseks säilitamiseks on soovitatav tooted joondada ja säilitada temperatuuril -80°C.Vältige sagedast külmutamist-sulatamist.
5) Toode sobib üheetapilise RT-qPCR jaoks, iga 25μL reaktsioonisüsteemi kohta on soovitatav lisada 10-20 U pöördtranskriptaasi või vastavalt tegelikule olukorrale järk-järgult suurendada pöördtranskriptaasi kogust.
Märkmed
1.Palun hoidke katseala puhas;Töötamise ajal tuleb kanda puhtaid kindaid ja maske.Kõik katses kasutatud tarbekaubad peaksid olema RNaasivabad, et vältida RNaasi saastumist.
2. RNA lagunemise vältimiseks tuleks kõik protseduurid läbi viia jääl.
3. Pöördtranskriptsiooni kõrge efektiivsuse tagamiseks on soovitatav võtta kvaliteetseid RNA proove.
4. See toode on mõeldud ainult uurimistööks.
5. Ohutuse tagamiseks kasutage laborikitleid ja ühekordseid kinnasid.
