Vaktsiiniaviiruse piiramise ensüüm

Vaccinia viirust piirav ensüüm pärineb rekombinantsest E. coli tüvest, mis kannab Vaccinia piirava ensüümi geene.See üksainus ensüüm koosneb kahest alaühikust (D1 ja D12) ja sellel on kolm ensümaatilist aktiivsust (RNA trifosfataas ja guanilüültransferaas D1 subühiku poolt ning guaniini metüültransferaas D12 subühiku poolt).Vaktsiiniaviiruse katmisensüüm katalüüsib tõhusalt kattestruktuuri moodustumist, mis võib spetsiifiliselt kinnitada 7-metüülguanülaadi korgistruktuuri (m7Gppp, Cap 0) RNA 5'-otsa.Korgi struktuur (Cap 0) mängib olulist rolli mRNA stabiliseerimisel, transpordil ja translatsioonil eukarüootides.RNA piiramine ensümaatilise reaktsiooniga on tõhus ja lihtne meetod, mis võib oluliselt parandada RNA stabiilsust ja translatsiooni in vitro transkriptsiooniks, transfektsiooniks ja mikrosüstimiseks.

Komponendid

Vaccinia viiruse piiramise ensüüm (10 U/μL)

10 × korkimispuhver

Säilitustingimused

-25～- 15 ℃ säilitamiseks (vältige korduvaid külmutamise-sulatamise tsükleid)

Salvestuspuhver

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glütserool.

Ühiku määratlus

Üks ühik vaktsiiniaviiruse piiravat ensüümi on defineeritud kui ensüümi kogus, mis on vajalik 10 pmol GTP lisamiseks 80 nt transkripti 1 tunni jooksul temperatuuril 37 °C.

Kvaliteedi kontroll

Eksonukleaas:10 U Vaccinia viiruse katmisensüümi koos 1 μg λ-Hind III seeditava DNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

Endonukleaas:10 U Vaccinia viiruse piiravat ensüümi koos 1 μg λDNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

Nickase:10 U vaktsiiniaviiruse piiravat ensüümi koos 1 μg pBR322-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

RNaas:10 U Vaccinia viiruse piiravat ensüümi koos 1,6 μg MS2 RNA-ga 4 tunni jooksul temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

1.coli DNA:10 U Vaccinia viiruse piiramisensüümi skriinitakse E. coli genoomse DNA olemasolu suhtes, kasutades TaqMan qPCR-i koos E. coli 16S rRNA lookuse suhtes spetsiifiliste praimeritega.E. coli genoomse DNA saastumine on ≤1 E. coli genoom.

2.Bakteriaalne Endotoksiin: LAL-test, vastavalt Hiina farmakopöa IV 2020. aasta väljaandele, geelipiiri katsemeetod, üldreegel (1143).Bakterite endotoksiinide sisaldus peaks olema ≤10 EU/mg.

Reaktsioonisüsteem ja tingimused

1. Korkimisprotokoll (reaktsiooni maht: 20 μL)

See protseduur on rakendatav 10 μg RNA (≥100 nt) sulgemisreaktsiooni korral ja seda saab vastavalt eksperimentaalsetele vajadustele suurendada.

I) Kombineerige 10 μg RNA-d ja nukleaasivaba H2O 1,5 ml mikrofuugituubis lõppmahuni 15,0 µL.*10 × korkimispuhver: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Kuumutage 5 minutit temperatuuril 65 ℃ ja seejärel 5 minutit jäävanni.

3) Lisage järgmised komponendid määratud järjekorras

*10 × korkimispuhver: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubeerige 37 °C juures 30 minutit, RNA on nüüd kaetud ja valmis järgnevateks rakendusteks.

2. 5′ klemm märgistamise reaktsioon (reaktsiooni maht: 20 μL)

See protokoll on loodud 5´ trifosfaati sisaldava RNA märgistamiseks ja seda saab vastavalt vajadustele suurendada.Märgise lisamise tõhusust mõjutavad RNA: GTP molaarsuhe, samuti GTP sisaldus RNA proovides.

1) Kombineerige sobiv kogus RNA-d ja nukleaasivaba H2O 1,5 ml mikrofuugituubis lõppmahuni 14,0 µL.

2) Kuumutage 5 minutit temperatuuril 65 ℃ ja seejärel 5 minutit jäävanni.

3) Lisage järgmised komponendid määratud järjekorras.

** GTP MIX viitab GTP-le ja vähesele hulgale markeritele.GTP kontsentratsiooni kohta vtmärkusele 3.

4) Inkubeerige 37 °C juures 30 minutit, RNA 5'-ots on nüüd märgistatud ja valmis allavoolu kasutamiseks

Rakendused

1. mRNA piiramine enne translatsiooniteste/in vitro translatsiooni

2. MRNA 5´ otsa märgistamine

Märkused kasutamise kohta

1.RNA lahuse kuumutamine enne inkubeerimist Vaccinia Capping Enzyme'iga eemaldab transkripti 5' otsast sekundaarse struktuuri.Pikendage aega 60 minutini teadaolevalt hästi struktureeritud 5-otstega transkriptsioonide puhul.

2. Korkimisreaktsioonides kasutatav RNA tuleb enne kasutamist puhastada ja suspendeerida nukleaasivabas vees.EDTA-d ei tohiks olla ja lahus ei tohi sisaldada soolasid.

3. 5´ otsa märgistamiseks peaks GTP kogukontsentratsioon olema ligikaudu 1-3 korda suurem kui mRNA molaarne kontsentratsioon reaktsioonis.

4. Reaktsioonisüsteemi mahtu saab vastavalt tegelikule mahule suurendada või vähendada.