PNGase F
Peptiid-N-glükosidaas F (PNGaas F) on kõige tõhusam ensümaatiline meetod peaaegu kõigi N-seotud oligosahhariidide eemaldamiseks glükoproteiinidest.PNGaas F on amidaas, mis lõhustub N-seotud glükoproteiinidest kõrge mannoosisisaldusega, hübriid- ja kompleksoligosahhariidide sisemiste GlcNAc ja asparagiini jääkide vahel.
Rakendus
See ensüüm on kasulik süsivesikute jääkide eemaldamiseks valkudest.
Ettevalmistus ja spetsifikatsioon
| Välimus | Värvitu vedelik |
| Valgu puhtus | ≥95% (SDS-PAGE-st) |
| Tegevus | ≥500 000 U/ml |
| Eksoglükosidaas | Tegevust ei tuvastatud (ND) |
| Endoglükosidaas F1 | ND |
| Endoglükosidaas F2 | ND |
| Endoglükosidaas F3 | ND |
| Endoglükosidaas H | ND |
| Proteaas | ND |
Omadused
| EÜ number | 3.5.1.52(rekombinantne mikroorganismist) |
| Molekulmass | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektriline punkt | 8. 14 |
| Optimaalne pH | 7,0-8,0 |
| Optimaalne temperatuur | 65 °C |
| Substraadi spetsiifilisus | Glükosiidsidemete lõhustamine GlcNAc ja asparagiini jääkide vahel Joonis 1 |
| Tunnustamise saidid | N-seotud glükaanid, välja arvatud juhul, kui need sisaldavad α1-3 fukoosi, joonis 2 |
| Aktivaatorid | DTT |
| Inhibiitor | SDS |
| Säilitustemperatuur | -25 ~ -15 ℃ |
| Kuumuse inaktiveerimine | 20 µl reaktsioonisegu, mis sisaldab 1 µL PNGaas F, inaktiveeritakse inkubeerimisega 75 °C juures 10 minutit. |
Joonis 1 PNGaasi F substraadi spetsiifilisus
Joonis 2 PNGase F tuvastuskohad.
Kui sisemised GlcNAc jäägid on seotud α1-3 fukoosiga, ei saa PNGaas F lõhustada glükoproteiinidest N-seotud oligosahhariide.See modifikatsioon on tavaline taimedes ja mõnedes putukate glükoproteiinides.
Ckomponendid
|
| Komponendid | Keskendumine |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × glükoproteiini denatureeriv puhver | 1000 µl |
| 3 | 10 × glükopuhver 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Ühiku määratlus
Üks ühik (U) on defineeritud kui ensüümi kogus, mis on vajalik >95% süsivesikute eemaldamiseks 10 µg denatureeritud RNaas B-st 1 tunni jooksul temperatuuril 37 °C reaktsiooni kogumahus 10 µL.
Reaktsioonitingimused
1. Lahustage 1–20 µg glükoproteiini deioniseeritud vees, lisage 1 µl 10 × glükoproteiini denatureerivat puhvrit ja vett (vajadusel), et saada reaktsiooni kogumahuks 10 µl.
2.Inkubeerige 100 °C juures 10 minutit, jahutage jääl.
3.Lisage 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ja segage.
4.Lisage 1–2 µl PNGaasi F ja H2O (vajadusel), et saada reaktsiooni kogumaht 20 µl ja segada.
5.Inkubeerige reaktsiooni temperatuuril 37 °C 60 minutit.
6.SDS-PAGE analüüsi või HPLC analüüsi jaoks.
