mRNA Cap2'-O-metüültransferaas

mRNA Cap 2'-O-metüültransferaas tuletati rekombinantsest E. coli tüvest, mis kannab vaktsiinia mRNA Cap 2'-O-metüültransferaasi geeni.See ensüüm lisab metüülrühma esimese nukleotiidi positsioonis 2'-O, mis külgneb RNA 5'-otsa cap-struktuuriga. Ensüüm kasutab S-adenosüülmetioniini (SAM) metüüldoonorina, et metüülida kaetud RNA (kork) -0), mille tulemuseks on cap-1 struktuur.

Cap1 struktuur võib suurendada translatsiooni efektiivsust, parandades mRNA ekspressiooni transfektsiooni- ja mikroinjektsioonikatsetes. See ensüüm vajab spetsiifiliselt RNA-d, millel on substraadina m7GpppN cap.See ei saa kasutada RNA-d, mille 5' otsas on pN, ppN, pppN või GpppN.Korgiga RNA võib valmistada in vitro transkriptsiooni teel, kasutades cap-analoogi, või ensümaatilise katmise teel, kasutades Vaccinia piiramisensüümi.

Komponendid

mRNA Cap 2´-O-metüültransferaas (50U/μL)

10 × korkimisreaktsiooni puhver

Säilitamine

-25 ～- 15 ℃ ladustamiseks (Vältige korduvaid külmutamise-sulatamise tsükleid)

Salvestuspuhver

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glütserooli.

Ühiku määratlus

Üks ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis on vajalik 10 pmooli 80 nt kaetud RNA transkripti metüülimiseks 1 tunni jooksul temperatuuril 37 °C.

Kvaliteedikontrolli analüüsid

Eksonukleaas:50 U mRNA Cap 2´-O-metüültransferaas koos 1 µg λ-Hind III lõhustatud DNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei anna agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

Endonukleaas: 50 U mRNA Cap 2´-O-metüültransferaasi koos 1 μg λDNA-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei too agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2´-O-metüültransferaasi koos 1 µg pBR322-ga temperatuuril 37 ℃ 16 tundi ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

RNaasi: 50 U mRNA Cap 2´ -O-metüültransferaasi koos 1,6 µg MS2 RNA-ga 4 tundi temperatuuril 37 ℃ ei põhjusta agaroosgeelelektroforeesiga määratud lagunemist.

E. coli DNA: 50 U mRNA Cap 2´-O-metüültransferaasi skriinitakseE. coli genoomne DNA, kasutades TaqMan qPCR-i koos selle jaoks spetsiifiliste praimeritegaE. coli 16S rRNA lookus.TheE. coli genoomne DNA saastumine on =1E. coli genoom.

Bakteriaalne Endotoksiin: LAL-test, vastavalt Hiina farmakopöa IV 2020. aasta väljaandele, geelipiiri katsemeetod, üldreegel (1143).Bakterite endotoksiinide sisaldus peaks olema =10 EU/mg.

Reaktsioonisüsteem ja tingimused

1. Kombineerige sobiv kogus kaetud RNA-d ja RNaasivaba H2O 1,5 ml mikrofuugituubis lõppmahuni 16,0 µL.

2. Kuumutage 5 minutit temperatuuril 65 ℃ ja seejärel 5 minutit jäävanni.

3. Lisage järgmised komponendid määratud järjekorras (Capped RNA metüülimiseks

vähem kui 10

*10x korkimisreaktsiooni puhver: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubeerige 37 ℃ juures 1 tund (vähem kui 200 nt sihtfragmendi puhul on soovitatav inkubeerida 2 tundi).

Rakendused

MRNA ekspressiooni parandamiseks mikrosüstimise ja transfektsiooni katsete ajal.

Märkused kasutamise kohta

1. Enne reaktsiooni RNA tuleb puhastada ja lahustada nukleaasivabas vees, kõik lahused ei tohi sisaldada EDTA-d ega ioone.

2. Soovitatav on RNA proovi kuumutada temperatuuril 65 ℃ 5 minutit enne reaktsiooni, et eemaldada transkripti 5' otsast sekundaarne struktuur.Seda saab pikendada 10 minutini keeruka 5 ´-terminali struktuuri jaoks.