Kaheahelaline RNA (dsRNA) ELISA KIT
See komplekt on ensüümseotud immunosorbentanalüüs (ELISA), mis on ühendatud biotiin-streptavidiini süsteemiga, et kvantitatiivselt mõõta dsRNA pikkust üle 60 aluspaari (bp), sõltumata järjestusest.Plaat on eelnevalt kaetud dsRNA-vastase antikehaga.Lisatakse proovis esinev dsRNA ja see seondub süvenditega kaetud antikehadega.Seejärel lisatakse biotinüülitud dsRNA-vastane antikeha, mis seondub proovis sisalduva dsRNA-ga.Pärast pesemist lisatakse HRP-Streptavidiin ja see seondub biotinüülitud anti-dsRNA antikehaga.Pärast inkubeerimist pestakse seondumata HRP-Streptavidiin ära.Seejärel lisatakse TMB substraadi lahus ja katalüüsitakse HRP abil, et saada sinine värvus, mis muutus pärast happelise stopplahuse lisamist kollaseks.Kollase tihedus on võrdeline plaadile püütud dsRNA sihtkogusega.Neeldumist mõõdetakse 450 nm juures.
Rakendus
See komplekt on mõeldud jääk-dsRNA kvantitatiivseks mõõtmiseks.
Komplekti komponendid
|
| Komponendid | HCP0033A-1 | HCP0033A-2 |
| 1 | Elisa mikroplaat | 8 × 6 | 8 × 12 |
| 2 | Biotinüülitud tuvastusantikeha (100x) | 60 μL | 120 µl |
| 3 | Hrp-streptavidiin (100x) | 60 μL | 120 µl |
| 4 | Lahjenduspuhver | 15 ml | 30 ml |
| 5 | Tmb substraadi lahus | 6 ml | 12 ml |
| 6 | Peatage lahendus | 3 ml | 6 ml |
| 7 | Kontsentreeritud pesupuhver (20x) | 20 ml | 40 ml |
| 8 | Standardne (UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 9 | Standardne (pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 10 | Standardne (N1-Me-pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 11 | Standardne (5-OMe-UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 12 | STE puhver | 25 ml | 50 ml |
| 13 | Plaadi tihendaja | 2 tükki | 4 tükki |
| 14 | Kasutusjuhend ja COA | 1 eksemplar | 1 eksemplar |
Ladustamine ja stabiilsus
1. Kasutamata komplekti jaoks: kogu komplekti võib säilivusaja jooksul hoida temperatuuril 2–8 ℃.Ladustamise stabiilsuse tagamiseks tuleks vältida tugevat valgust.
2. Kasutatud komplekti puhul: pärast mikroplaadi avamist katke kasutamata süvendid plaadisulguriga ja naaske kuivatusaine pakendit sisaldavasse fooliumkotti, sulgege fooliumkott tõmblukuga ja viige võimalikult kiiresti pärast kasutamist temperatuurini 2–8 ℃.Teised reaktiivid tuleb võimalikult kiiresti pärast kasutamist tagasi viia temperatuurile 2–8 ℃.
Vajalikud, kuid mitte kaasatud materjalid
1. Mikroplaadilugeja 450±10nm filtriga (parem, kui suudab tuvastada lainepikkustel 450 ja 650 nm).
2. Mikroplaadi loksutaja.
3. RNaasivabad otsikud ja tsentrifuugitorud.
Operatsiooni vooskeem
Enne alustamist
1. Enne kasutamist viige kõik komplekti komponendid ja proovid toatemperatuurile (18–25 ℃).Kui komplekti ei kasutata ühe korraga ära, võtke käesoleva katse jaoks välja ainult ribad ja reaktiivid ning jätke ülejäänud ribad ja reaktiivid nõutavasse seisukorda.
2. Pesupuhver: lahjendage 40 ml 20x kontsentreeritud pesupuhvrit 760 ml deioniseeritud või destilleeritud veega, et valmistada 800 ml 1x pesupuhvrit.
3. Standard: enne kasutamist tsentrifuugige või tsentrifuugige põhilahust korraks.Nelja esitatud standardi kontsentratsioon on 5 ng/μL.UTP ja pUTP dsRNA standardite jaoks lahjendage standardkõvera joonistamiseks põhilahus STE puhvriga kontsentratsioonini 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL.N1-Me-pUTP dsRNA standardite puhul lahjendage standardkõvera joonistamiseks põhilahus STE puhvriga kontsentratsioonini 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL.5-OMe-UTP dsRNA standardi jaoks lahjendage standardkõvera joonistamiseks põhilahus STE puhvriga kontsentratsioonini 4,2,1,0,5, 0,25,0,125, 0,0625, 0 pg/μL.Soovitame standardeid lahjendada järgmiste graafikutena:
|
N1-Me-pUTP dsRNA standardid | |||
|
Ei. |
Final Con. (pg/μL) | Lahjendusjuhend | |
| STE puhver |
standard | ||
|
A
B C D E F G H | 100
2
1 0.5 0,25 0. 125 0,0625 0,0312 0 | 49 µl
490 µl
250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl | 1μL 5ng/μL standard 10μL 100pg/μL lahendus 250 µl lahust A 250 µl lahust B 250 µl lahust C 250 µl lahust D 250 µl lahust E 250 µl lahust F / |
| 5-OMe-UTP dsRNA standardi jaoks | |||
|
Ei. |
Final Con. (pg/μL) | Lahjendusjuhend | |
| STE puhver |
standard | ||
|
A
B C D E F G H |
100
4
2 1 0.5 0,25 0. 125 0,0625 0 |
49 µl
480 µl
250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl | 1μL 5ng/μL standard 20μL 100pg/μL lahendus 250 µl lahust A 250 µl lahust B 250 µl lahust C 250 µl lahust D 250 µl lahust E 250 µl lahust F / |
4. Biotinüülitud tuvastamisantikeha ja HRP-streptavidiini töölahus: enne kasutamist tsentrifuugige või tsentrifuugige põhilahust korraks.Lahjendage need lahjenduspuhvriga töökontsentratsioonini.
5. TMB substate: aspireerige vajalik annus lahust steriliseeritud otsikutega ja ärge valage jääklahust uuesti viaali.TMB alamolek on valguse suhtes tundlik, ärge jätke TMB substraati pikaks ajaks valguse kätte.
Protokolli kasutamine
1. Määrake analüüsiks vajalike ribade arv.Sisestage ribad kasutamiseks raamidesse.Ülejäänud plaadiribad, mida selles testis ei kasutata, tuleb uuesti pakkida kuivatusainega kotti.Sulgege kott külmkapis hoidmiseks tihedalt.
2. Lisage vastavatesse süvenditesse 100 μL iga standard-, pimekatse ja proovi lahjendust.Katke plaaditihendiga.Inkubeerige 1 tund toatemperatuuril, loksutades kiirusel 500 pööret minutis.Täpse analüüsi jaoks tuleb proove lahjendada STE puhvriga sobiva kontsentratsioonini.
3. Pesemisetapp: aspireerige lahus ja peske igasse süvendisse 250 μL pesupuhvriga ning laske 30 sekundit seista.Visake pesupuhver täielikult ära, klõpsates plaadi imavale paberile.Täielikult 4 korda pesta.
4. Lisage igasse süvendisse 100 μL biotinüülitud detekteerimisantikehade töölahust.Katke plaaditihendiga.Inkubeerige 1 tund toatemperatuuril, loksutades kiirusel 500 pööret minutis.
5. Korrake pesemisetappi.
6. Lisage igasse süvendisse 100 μL HRP-streptavidiini töölahust.Katke plaaditihendiga.Inkubeerige 30 minutit toatemperatuuril, loksutades kiirusel 500 pööret minutis.
7. Korrake pesemisetappi uuesti.
8. Lisage igasse süvendisse 100 μL TMB substraadi lahust.Katke plaaditihendiga.Inkubeerida 30 minutit toatemperatuuril Kaitsta valguse eest.Substraadilahuse lisamisel muutub vedelik siniseks.
9. Lisage igasse süvendisse 50 μL stopplahust.Stop-lahuse lisamisel muutub vedelik kollaseks.Seejärel käivitage mikroplaadilugeja ja viige mõõtmine kohe läbi 450 nm juures.
Tulemuste arvutamine
1. Keskmistage iga standardi, kontrolli ja proovi topeltnäidud ning lahutage keskmine nullstandardne optiline tihedus.Koostage standardkõver, mille neeldumine on vertikaalsel (Y) teljel ja dsRNA kontsentratsioon horisontaalteljel (X）).
2. Arvutamine on soovitatav teostada arvutipõhise kõvera sobitamise tarkvaraga, nagu curve expert 1.3 või ELISA Calc 5 või 4 parameetriga mittelineaarse sobitusmudeliga.
Esitus
1. Tundlikkus:
tuvastamise alumine piir: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA puhul), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA puhul).
kvantifitseerimise alumine piir: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA jaoks), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA jaoks), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA jaoks).
2. Täpsus: Intra-Assay CV ≤10%, Inter-Assay CV ≤10%
3. Taastumine: 80% ~ 120%
4. Lineaarsus: 0,0156–0,5 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA jaoks) 0,0312–1 pg/μL (N1-Me-pUTP dsRNA jaoks), 0,0625–1 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA jaoks).
Kaalutlused
1. TMB reaktsiooni temperatuur ja aeg on kriitilised, palun kontrollige neid vastavalt juhistele rangelt.
2. Analüüsi hea reprodutseeritavuse ja tundlikkuse saavutamiseks on oluline plaate korralikult pesta, et eemaldada liigsed reageerimata reaktiivid.
3. Kõik reaktiivid tuleb enne kasutamist põhjalikult segada ja vältida proovi või reaktiivide lisamise ajal tõrkeid.
4. Kui kontsentreeritud pesupuhvris (20x) on moodustunud kristallid, soojendage temperatuurini 37 ℃ ja segage õrnalt, kuni kristallid on täielikult lahustunud.
5. Vältige naatriumasiidi (NaN3) sisaldavate proovide analüüsimist, kuna see võib hävitada HRP aktiivsuse, mille tulemuseks on dsRNA koguse alahindamine.
6. Vältige analüüsi ajal RNaasi saastumist.
7. Standardi/proovi, tuvastamisantikeha ja SA-HRP võib läbi viia ka toatemperatuuril raputamata, kuid see võib põhjustada tuvastamise tundlikkuse ühekordse vähenemise.Sel juhul soovitame UTP ja pUTP dsRNA standardeid lahjendada 2 pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA standardeid 4 pg/μL ja 5-OMe-UTP dsRNA standardeid 8 pg/μL.Lisaks inkubeerige HRP-streptavidiini töölahust 60 minutit toatemperatuuril.Ärge kasutage kolviloksutit, sest kolviloksuti võib põhjustada ebatäpse tulemuse.
Tüüpiline tulemus
1. Standardkõvera andmed
| kontsentratsioon (pg/μl) | N1-Me-pUTP modifitseeritud dsRNA standard | ||
| OD450-OD650 (1) | OD450-OD650(2) | KESKMINE | |
| 2 | 2,8412 | 2,7362 | 2,7887 |
| 1 | 1,8725 | 1,9135 | 1,8930 |
| 0.5 | 1,0863 | 1.1207 | 1.1035 |
| 0,25 | 0,623 | 0,6055 | 0,6143 |
| 0,125 | 0,3388 | 0,3292 | 0,3340 |
| 0,0625 | 0,1947 | 0,1885 | 0,1916 |
| 0,0312 | 0. 1192 | 0,1247 | 0,1220 |
| 0 | 0,0567 | 0,0518 | 0,0543 |
2. Standardkõvera arvutamine
3. Voodri tuvastamise vahemik: 0,0312-1 pg/μL
| Kontsentratsioon (pg/μl) | OD450-OD650 |
| 1 | 1,8930 |
| 0.5 | 1.1035 |
| 0,25 | 0,6143 |
| 0,125 | 0,3340 |
| 0,0625 | 0,1916 |
| 0,0312 | 0,1220 |
